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1，3-丙二醇（1，3-propanediol，简记1，3-PD）是一种重要的化工原料的中间产物，是工业生物技术领域研究的重要产品之一。最主要的用途是作为一种重要的单体原料，其可以合成多种重要的化工产品如:聚酯、聚醚和聚氨酯。其中，作为单体与对苯二甲酸合成新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，具有许多优良特性如:生物可降解性、安全无毒等，这是许多其它合成塑料所不具有的。1，3-PD主要用于增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成，也用于食品、化妆品和制药等行业。 目前用于生物合成1,3-PD的菌种主要有Clostridium pasteurianum、Clostridiumbutyricum、Clostridium freundii、Klebsiella pneumoniae和Klebsiella oxytoca等。本实验室前期关于K.oxytoca的研究较多，其为兼性厌氧细菌，遗传操作较为方便简单;该菌可耐受较高浓度甘油与1，3-PD，具有较高的1，3-PD生产率和得率;该菌还可直接以废弃甘油为底物进行1，3-PD生产。目前，该菌厌氧发酵甘油生产1，3-PD的途径已比较清楚，一个关键问题是:催化该途径第一步反应的二醇脱水酶需要在辅酶B12的辅助下才具有催化活性，但是很容易失活，因此成为关键性限速酶，限制了1，3-PD的生物合成。 为解决这一问题，本研究拟利用基因工程手段将来源于Clostridium butyricumDSM10702的的甘油脱水酶(一种二醇脱水酶的同工酶，但催化过程不依赖于辅酶B12)导入K.oxytoca中，以提高1，3-PD合成效率。本研究以实验室前期构建的1，3-PD高产菌K.oxytoca DA-1HB为出发菌，初步研究了上述策略的可行性。 首先，对出发菌的形态、分子特性和生理生化特性进行了重新鉴定，并对该菌进行了遗传稳定性和发酵特性的研究。 其次，对购自德国微生物菌种保藏中心的菌株Clostridium butyricum DSM10702利用16S rDNA进行了鉴定，证实其为丁酸梭菌。 第三，利用基因工程手段扩增了C.butyricum DSM10702基因组中的甘油脱水酶基因及其激活因子序列，为避免有毒中问产物3-羟基丙醛积累，同时扩增了位于同一操纵子（1，3-PD操纵子）上的1，3-PD脱氢酶基因（编码1，3-PD合成途径的第二个酶）。通过连接到T vector测序，发现该操纵子与GenBank报道的C.butyricum的1，3-PD操纵子序列（序列号AY112989）具有96.07％的同源性，进一步扩增和测序研究发现该差异性源于菌种间差异。随后，利用含不同启动子的表达载体构建了表达质粒，并电转化到K.oxytoca DA-1HB中，筛选获得了携带不同表达质粒的重组产酸克雷伯氏菌。初步摇瓶发酵实验发现，携带有表达质粒pIPK的重组菌K.oxytoca PK的1，3-PD产量提高52.7％。对表达质粒在重组菌K.oxytoca PK中进行了重组质粒稳定性研究表明:重组菌PK的质粒稳定性良好，在前80代保持了100％的稳定性，从80代开始LBK+平板结果显示质粒稳定性略微下降，但是仍然保持在较高的水平。 本研究通过基因工程手段在K.oxytoca中构建了不依赖辅酶B12的1，3-PD合成途径，并对质粒的稳定性及重组菌进行了初步发酵研究，对促进生物法合成1，3-PD的工业化进程具有重要意义。另外，该不依赖于辅酶B12的甘油脱水酶的1，3-PD操纵子的成功克隆，将为应用于体外酶催化转化过程提供依据。