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酵母菌,特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),是研究真核生物生命活动规律的理想模式生物,同时也是重要的工业微生物。在工业化生产过程中,酵母菌常常面临多种环境胁迫的影响,导致细胞生长和代谢活性降低,从而影响发酵性能。研究酿酒酵母的环境胁迫响应机制,并进行胁迫耐受性改造,对提高酵母菌的工业环境适应性和生产效率具有重要意义。 真核翻译起始因子5A(eIF5A)是古细菌和真核生物中普遍存在的在进化上高度保守的小分子酸性蛋白,也是目前已知的唯一需要进行一种特殊的蛋白质翻译后修饰过程,即8-羟基-2,7,10-三氨基癸酸(Hypusine)修饰,才能变的有活性的蛋白质。eIF5A与细胞中的许多生命活动有关,是细胞增殖和分化的关键调控因子。本研究通过调控eIF5A活性水平,探究了eIF5A在酿酒酵母环境胁迫响应中的功能。 将eIF5A前体蛋白编码基因HYP2、翻译后修饰酶基因DYS1和LIA1在酿酒酵母YS58中分别进行高表达,检测对酵母菌胁迫耐受性的影响。结果发现,提高HYP2表达水平对酵母菌的耐热性、糠醛耐受性和乙醇耐受性没有明显影响,但可以明显提高酵母菌对乙酸胁迫的耐受性。在0.5%(v/v)乙酸条件下,高表达HYP2可以使细胞生长延滞期缩短23.3%,细胞生长效率提高9.8%;在0.6%(v/v)乙酸胁迫条件下,对照菌株基本不能生长,而HYP2高表达重组菌株在经历了较长的延滞期后依然能够很好地生长。在1.2%(v/v)乙酸胁迫条件下处理6h,高表达HYP2使细胞存活率提高了29%。提高eIF5A翻译后修饰相关酶基因DYS1和LIA1的表达水平对酵母菌的各种胁迫耐受性均没有明显影响。上述结果表明,高水平表达的eIF5A前体蛋白可以在细胞已有的翻译后修饰相关酶的作用下转化为活性蛋白,调控细胞生物学过程,从而增强酵母细胞对乙酸胁迫的耐受性。 为了探究eIF5A介导乙酸胁迫耐受性的分子机制,在文献调研的基础上,对酿酒酵母基因组编码的含连续脯氨酸基序(PolyPro)的蛋白质、与乙酸胁迫耐受性可能相关的蛋白质进行了生物信息学分析和功能聚类。通过在这些蛋白羧基端连接绿色荧光蛋白GFP标签表征蛋白质表达水平,研究了eIF5A对可能与乙酸胁迫耐受性相关的PolyPro蛋白的调控作用。结果表明,乙酸胁迫条件下,高表达eIF5A使Ume6p、Hrk1p、Sch9p的表达水平有不同程度的提高,涉及到转录调控、降低胞内乙酸含量、压力信号转导等生物学过程,其中对转录因子Ume6p的上调作用最明显(提高了172%)。进一步对Ume6p下游的靶基因进行了分析,发现乙酸胁迫条件下,由eIF5A介导的Ume6p表达水平的提高对调节细胞壁重构的基因BEM4和维持核糖体稳定性的基因BUD21的表达均表现出了明显的激活作用,说明eIF5A可能通过这些生物学过程协同作用增强酵母细胞对乙酸胁迫的耐受性。 本研究揭示了真核翻译起始因子eIF5A在酵母菌乙酸胁迫响应中的生理功能,并初步揭示了其分子机制,不但为酵母菌乙酸胁迫耐受性改造提供了新的遗传修饰靶点,而且为全面揭示高等真核生物eIF5A生理功能奠定了基础。