论文部分内容阅读
研究背景和目的：肺癌是当今世界对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，约70％-80％的患者初诊时已属疾病中、晚期，失去手术机会。虽然辅助化疗在防治复发、转移等方面具有确切疗效，新的化疗药物也在不断问世，但对于晚期非手术肺癌患者的疗效仍维持在较低的水平，有效率仅20％-40％，5年生存率只有15％。特别是非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）对化疗药物不敏感，其原因之一即由于癌细胞内在的和（或）获得性多药耐药性（multidrug resistance，MDR）的产生。化疗耐药已成了肿瘤治疗中的主要障碍，临床上迫切需要有新的方法用于肺癌治疗。研究表明在大多数人类肿瘤中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达均上调，血管内皮生长因子可特异作用于内皮细胞刺激新生血管形成，影响肿瘤的生长、转移和预后。新生血管形成是肿瘤生长、侵袭和转移过程中的必需条件，而破坏或抑制肿瘤血管生成即是抗血管生成疗法的目标。贝伐单抗（Bevacizumab，Avastin）是一种重组人源化单克隆抗体，通过与血管内皮生长因子高亲和力结合，阻断血管生成而发挥抗肿瘤作用。临床前研究发现，在不考虑给药方式或接种部位的情况下，单药贝伐单抗在20种（13个肿瘤类型）不同的人肿瘤裸鼠移植瘤模型中均能拮抗肿瘤的生长，个别实验还观察到有显著的抑制肿瘤转移的作用。贝伐单抗作为第一个被美国药品和食品管理局（FDA）批准通过用于抑制血管生成发挥抗癌作用的药物，无论是单独或与其它化疗药物联用，均可以减少肿瘤血管生成，取得较好临床疗效。目前贝伐单抗正应用于一系列Ⅱ／Ⅲ期临床试验，并在非小细胞肺癌、结直肠癌和肾癌中取得了令人鼓舞的结果。我们的目的是研究贝伐单抗对荷人肺腺癌A549／DDP（顺铂耐药表型）移植瘤生长抑制的效果，提供临床前实验数据，为建立肺癌生物化疗的新模式奠定基础。具体内容如下：1．鉴定耐顺铂人肺腺癌A549／DDP细胞的耐药特性并分析其耐药机制，将A549／DDP耐药细胞接种入裸鼠体内以建立荷A549／DDP裸鼠皮下移植瘤模型。2．初步探讨VEGF单克隆抗体贝伐单抗联合或不联合顺铂对荷A549／DDP裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法：1．进行三种细胞（A549、A549／DDP、SKOV-3）的传代培养，以备实验用。采用MTT法描绘A549亲本细胞和A549／DDP耐药细胞的生长曲线；流式细胞仪比较A549亲本细胞和A549／DDP耐药细胞的细胞周期；两株细胞用顺铂诱导24小时再经AnnexinV和PI双染后检测比较细胞平均凋亡率的差异；MTT法计算A549／DDP耐药细胞与A549亲本细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50)和耐药系数（RI）；检测A549／DDP耐药细胞对其它5种临床常用化疗药物（卡铂、长春新碱、表阿霉素、吉西他滨及紫杉醇）的交叉耐药谱；应用逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）进一步分析A549和A549／DDP两种细胞系关于VEGF、凋亡基因（bcl-2）及耐药基因（MDR1、LRP、GST-π）的mRNA表达情况。2．建立肺腺癌耐药细胞A549／DDP裸鼠皮下移植瘤模型，将25只荷A549／DDP移植瘤裸鼠随机分成5组进行药物治疗（瘤直径至少为5mm）。具体治疗如下：①空白对照组（A组）：无菌生理盐水；②单药贝伐单抗组（B组）：5mg／kg；③单药顺铂组（C组）：4mg／kg；④联合1组（D组）：贝伐单抗5mg／kg+顺铂4mg／kg；⑤联合2组（E组）：贝伐单抗5mg／kg+顺铂2mg／kg。其中，经顺铂治疗组（C、D、E组）于用药前30分钟皮下注射赛格恩（3mg／kg）预防胃肠道反应。均为腹腔注射（0.5ml／只／次），2次／周，连续用药4周，观察裸鼠移植瘤生长状况。停药1周后处死各组裸鼠，称重并收集皮下移植瘤标本测量瘤质量，计算抑瘤率；免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测各组移植瘤组织的微血管密度（microvessel density，MVD）；RT-PCR进一步分析各组经药物治疗后凋亡基因bcl-2及耐药基因（LRP、GST-π）mRNA的表达情况。3．实验数据以“均数±标准差”表示，应用SPSS13.0软件对各结果进行分析。两种细胞的细胞周期差异及凋亡基因bcl-2及耐药基因（MDR1、LRP、GST-π）mRNA的表达情况均采用独立样本t检验；经顺铂药物诱导前后细胞平均凋亡率的比较采用配对样本t检验及独立样本t检验；药物敏感性实验采用配对样本t检验；三种细胞（A549、A549／DDP、SKOV-3）VEGFmRNA的表达情况采用Dunnett法（SKOV-3为阳性对照细胞）；各动物实验组的抑瘤率、微血管密度及各组移植瘤组织中凋亡基因bcl-2及耐药基因（LRP、GST-π）mRNA的表达情况均采用One-way ANOVA单向方差分析（Least-significant-Difference，LSD法）。P≤0.05为差异有统计学意义。结果：1．细胞生长曲线显示，A549细胞和A549／DDP耐药细胞在细胞增殖方面存在一定差异。A549／DDP耐药细胞的生长较亲本细胞快，指数生长期早于A549细胞。流式细胞仪检测显示，A549／DDP耐药细胞与A549亲本细胞在细胞周期上有显著差异，前者S期细胞增多（51.73±0.44）％，（P＜0.001），95％可信区间为[36.07，37.94]，G1期细胞减少（37.25±0.21）％，（P＜0.001），95％可信区间为[43.30，44.18]，提示A549／DDP耐药细胞DNA合成增加。A549亲本细胞经顺铂（10μg／ml）诱导24小时后细胞凋亡率从原来的（5.32±0.19）％增加到（34.57±2.24）％，（P=0.002），95％可信区间为[24.15，34.36]，有显著的凋亡效应；而A549／DDP耐药细胞经药物作用前后平均凋亡率差异仅（0.46±0.25）％，（P=0.086），无明显变化，可见顺铂诱导两种细胞凋亡之间有显著差异（P＜0.001）。A549亲本细胞和A549／DDP耐药细胞对顺铂的IC50分别为（5.35±0.37）μM／L、（92.88±4.10）μM／L（P=0.001），耐药系数（RI）为17.36。交叉耐药实验表明，A549／DDP耐药细胞对卡铂（CBP）、表阿霉素（EPI）及紫杉醇（TAX）的耐药系数分别为6.23、4.64和20.80，（P≤0.002），而对长春新碱（RI=1.39）和吉西他滨（RI=1.09）则无交叉耐药；半定量RT-PCR结果显示，在A549／DDP耐药细胞中bcl-2、LRP、GST-πmRNA的表达均较A549亲本细胞显著增高（P＜0.001），而MDR1mRNA未见表达；同时通过与SKOV-3细胞对比办证实A549亲本细胞和A549／DDP耐药细胞均高表达VEGF。2．治疗结束后顺铂常规剂量组（C、D组）裸鼠体重较其它各组均减轻（P≤0.001），而其余各组之间体重无显著差异（P=0.928）。与空白对照组相比，经贝伐单抗治疗组（B、D、E组）的移植瘤生长显著受到抑制，其抑瘤率分别为20.96％、51.67％、50.95％，差异均有统计学意义（P＜0.001），且联合用药组（D、E组）作用最佳，单药顺铂组抑瘤率仅为0.30％，与对照组之间无显著差异（P=0.632），两个联合用药组之间的抑瘤率也无差异（P=0.262）；经贝伐单抗治疗组（B、D、E组）的微血管密度表达显著下降（分别为18.6±1.14、13.6±1.14、14.4±0.55），P值均＜0.001；同时RT-PCR结果亦显示，与空白对照组相比，经贝伐单抗治疗组（B、D、E组）bcl-2mRNA表达下调（P＜0.001），但该三组之间无差异，实验各组之间在耐药基因LRP、GST-πmRNA表达上均未见显著差异。结论：1．经鉴定耐顺铂人肺腺癌A549／DDP细胞具有多重耐药性，其细胞生物学性状的改变可能与之相关。该细胞抗药性能明显、稳定，同时A549／DDP耐药细胞VEGF（为贝伐单抗的治疗靶点）高表达，非常适合用于本实验研究。2．A549／DDP耐药细胞可抵抗顺铂诱导的细胞凋亡，其机理可能与bcl-2及耐药基因（LRP及GST-p）的过度表达有关。3．贝伐单抗对荷A549／DDP裸鼠移植瘤有显著抑制作用，同时提高A549／DDP耐药细胞对顺铂的敏感性，两者联合用药有显著的协同效应，其作用机制可能与抑制其微血管形成、诱导细胞凋亡增加有关。4．肿瘤血管生成抑制剂和传统细胞毒药物联用是针对非鳞、非小细胞肺癌的新的治疗模式。