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疗的研究提供理论基础。
材料和方法：
SCCHN组织标本：60例头颈鳞癌原发灶和颈部淋巴结转移灶样本及10例癌旁正常口腔黏膜组织样本。患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色，分别由两名病理医师诊断，进行临床病理分期。60例SCCHN中包括：肿瘤直径≤4cm者49例，直径>4cm者11例，临床病理分期显示Ⅰ-Ⅱ期28例，Ⅲ-Ⅳ期32例，伴淋巴结转移30例，无淋巴结转移30例。
细胞系：人CCR7高表达头颈部鳞癌淋巴结转移细胞系PCI-37B(由匹兹堡大学肿瘤研究所惠赠)。
免疫组化染色：SP法检测头颈鳞癌无淋巴结转移的原发灶和无转移的淋巴结，伴淋巴结转移的原发灶和淋巴结转移灶及癌旁正常组织的PYK2蛋白表达情况。组织切片常规脱蜡并水化。染色步骤简述如下：0.1mol/L Tris-HCI(pH10.0)缓冲液，高温高压修复抗原2.5min；3％H2O2和5%山羊血清37℃下分别孵育切片1h；-抗(兔多克隆抗PYK2抗体，1:200稀释)4℃孵育过夜；山羊抗兔IgG和SP复合物37℃分别孵育切片30min；最后DAB显色，苏木素复染细胞核。两名病理诊断医师分别对组织切片染色情况进行评分。胞浆出现棕黄色颗粒视为阳性细胞。至少5个高倍视野下(400×)评价PYK2染色细胞百分比：细胞无染色或染色<10%=(-)，11-50%=(+)，51-75%=(++)，>76%=(+++)。
趋化实验：采用Transwell趋化小室法检测。将加入不同处理因素的细胞消化离心后计数，在趋化小室的下室加600μl低糖DMEM，内含0.5%BSA及500ng/mlCCL19，将1×106/ml细胞接种于趋化小室的上室200μl，以无CCL19刺激的正常细胞为空白对照组，每组3个复孔。24小时后结晶紫染色，随机选取5个高倍视野计数迁移细胞数。实验重复三次，取平均值。
侵袭实验：在趋化小室的多聚碳酸脂膜上预先铺入1:8稀释的Matrigel基质胶，4℃风干。趋化小室在孵育箱中作用时间延长至36小时。其他步骤同趋化实验。
Western blot实验：对数生长期的细胞饥饿24小时，细胞进行分组处理后，采用含有PMSF和磷酸酶抑制剂混合物的M-PER(PIERCE)蛋白提取试剂提取细胞蛋白。考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，上样总蛋白为80μg。SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，5%BSA封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗IgG37℃孵育2小时，最后酶显法，显色剂显色。ImageJ软件用于半定量分析特异性条带的光密度值，将目的蛋白与β-actin光密度比值作为相对表达量。实验至少重复3次，取平均值。
免疫荧光实验：PCI-37B细胞经过不同处理后，经过戊二醛固定，透膜和TRITC标志的鬼笔环肽染色。每步之间PBS冲洗2遍，每次10分钟，最后再用PBS冲洗2遍后用荧光电子显微镜进行观察。重复上述实验四到五次，以取得最佳结果。
统计学分析：SPSS13.0统计软件用于数据分析处理。PYK2表达与临床病理因素的关系用X2检验，p<0.05为有统计学意义。其他实验采用t检验，结果用mean士sd表示，p<0.05有统计学意义。
实验结果：
1、PYK2在伴淋巴结转移的头颈鳞癌原发灶及转移灶高表达
通过免疫组化实验，我们检测了PYK2在头颈鳞癌原发灶及淋巴结转移灶和非转移淋巴结及正常口腔黏膜的表达情况。PYK2主要表达于肿瘤和淋巴结转移细胞的细胞质。在伴淋巴结转移的原发灶及淋巴结转移灶中高表达，而在无转移的原发灶低表达，在正常的口腔黏膜和非转移淋巴结低表达或无表达。统计分析结果显示：PYK2表达与头颈鳞癌的临床病理分期和淋巴结转移密切相关，而与患者的年龄及肿瘤大小无关。
2、PYK2的活化与CCL19诱导的头颈鳞癌淋巴结转移细胞PCI-37B的趋化和侵袭能力相关
应用PYK2抑制剂tyrphostin A9和CCR7抗体对PCI-37B细胞进行处理后，通过趋化实验检测细胞的趋化能力。实验结果显示：与无诱导剂的空白对照组相比，CCL19诱导可显著增强细胞的趋化能力。PYK2抑制剂tyrphostin A9和CCR7抗体可显著降低CCR7介导的PCI-37B细胞趋化能力。我们进一步研究了CCL19诱导的头颈鳞癌细胞的侵袭能力，与对照组比，CCL19显著增强头颈鳞癌淋巴结转移细胞PCI-37B的侵袭能力，而tyrphostin A9明显抑制CCL19诱导的癌细胞的侵袭能力。
3、头颈鳞癌淋巴结转移细胞PCI-37B中CCR7在PYK2活化中的作用
已有研究发现PYK2蛋白参与趋化因子受体介导的信号通路，所以我们研究在淋巴结转移的头颈鳞癌细胞中PYK2是否参与CCR7介导的信号通路。应用CCL19处理细胞不同时间，之后应用western blot实验检测p-PYK2(Tyr402)的蛋白表达量。实验结果显示用CCL19(200ng/ml)刺激PCI-37B细胞2分钟即出现PYK2的磷酸化，5-10分钟p-PYK2达最大值，60分钟后回到基态水平。应用CCR7抗体或tyrphostin A9对细胞进行预处理，应用CCL19(200ng/ml)处理细胞10分钟后检测p-PYK2的蛋白表达量，发现与无抑制剂组相比p-PYK2的蛋白表达量显著减少。
4、CCR7通过PYK2抑制PCI-37B细胞cofilin的失活
Cofilin蛋白活化可使细胞的肌动蛋白边缘聚集，细胞形成伪足，促进细胞的运动。Cofilin的ser-3磷酸化是其失活状态。我们分析cofilin是否参与PYK2介导的信号通路。Western blot结果显示：CCL19抑制PCI-37B细胞cofilin的磷酸化，即CCL19使cofilin保持活化状态，利于细胞的运动。Tyrphostin A9预处理的细胞与未经过预处理的细胞相比，cofilin的ser-3磷酸化显著增加，即PYK2抑制剂明显抑制cofilin的活化。因此，我们认为CCR7通过PYK2调控cofilin的活化。
5、CCR7通过PYK2介导PCI-37B细胞骨架的重组
细胞的运动过程需要细胞骨架蛋白的参与，我们通过免疫荧光实验，发现在无CCL19诱导情况下，F-actin主要分布于核周，且呈均匀弥散状态。应用CCL19诱导后PCI-37B细胞F-actin表达增加，并且向边缘聚集成束，细胞丝状伪足增加。应用tyrphostin A9预处理的细胞在加入CCL19后与无诱导剂相比无明显变化。这一结果表明PYK2参与CCR7介导的细胞骨架的重组。
结论：
1、PYK2过表达与头颈鳞癌淋巴结转移和临床病理分期正相关。
2、PYK2参与CCR7调控的PCI-37B细胞的细胞骨架重组。
3、CCR7通过PYK2/cofilin调控PCI-37B细胞的趋化和侵袭能力，PYK2与CCR7介导的头颈鳞癌细胞的淋巴结转移相关。