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青霉素G酰化酶是半合成抗生素工业中的关键酶之一,在国内发展前景良好。本课题是对重组大肠杆菌DH5α/pKKFPGA组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶发酵优化的研究。研究分为两个阶段：摇瓶水平上考察了某些发酵影响因素；5L发酵罐上进行发酵过程特性研究和放大,并结合摇瓶考察所得的结论优化。
第一阶段,首先改进了酶活力测量方法,系统研究了影响酶活力测定准确性的因素,为进一步发酵优化研究奠定了基础。随后确定了种龄、接种量等发酵基本条件。碳源研究中发现了本课题菌株对葡萄糖特殊的敏感性：葡萄糖在浓度2g/L以上开始抑制生长；对青霉素酰化酶表达抑制浓度更低,质量百分比10-4数量级上即显现出抑制效果。研究表明,不同宿主的重组菌对葡萄糖的敏感性无显著差异,并都以糊精为最佳培养基碳源。选择糊精为碳源,并在培养中添加100mg/L的氨苄青霉素,可在60h前保持质粒稳定性70％以上。
在对金属离子影响的考察中,发现Ca2+对成熟酶形成影响明显,经研究它作用在跨膜转运和周质前体处理的环节上。而Mg2+有一定负作用,可能是其与Ca2+的竞争的结果。对金属离子考察的结果表明,复杂的翻译后处理过程同样可能成为青霉素酰化酶形成瓶颈。
第二阶段在5L发酵罐上,结合摇瓶水平上葡萄糖敏感性的结论,改进为混合碳源发酵,菌浓和体积酶活得到了明显的提高,分别达到13.9g/L和10265.5U/L。
在以糊精为基础碳源,流加葡萄糖稀溶液的混合碳源发酵中,pH补料控制方法以其简单、能反映各种情况和其灵敏又稳定的特性被选为最佳方式。控制pH补料的发酵中,最高菌浓和最高体积酶活分别为15.0g/L和12764.5U/L。调节补料速率来保持溶氧理论上能提高酶活,由于其不易控制的特性使它难以运用。