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微生物数量检测是微生物分析检测中的重要项目,传统的微生物检测方法费时费力,不能满足食品、药品及化妆品企业进行生产过程控制和环境卫生监督等现场检测的要求。本研究根据ATP生物发光原理,从筛选和优化微生物细胞ATP释放剂着手,探索微生物细胞ATP释放剂的作用机理,建立起系统的ATP生物发光微生物快速检测新技术,成功地将其应用于饮用水微生物快速检测。同时为了了解生活饮用水臭氧—生物活性炭(O3-BAC)深度水处理工艺的微生物功能及安全性情况,以运行中的BAC为材料,对其微生物菌群进行系统分析和研究。取得的主要结论如下:
1、筛选出微生物细胞ATP释放剂Ec,建立了室温条件下简便、快速的微生物细胞ATP释放方法。在微生物细胞ATP释放剂的筛选研究中,发现7.5 g/L环糊精CD(a)能完全中和1.5 g/L的表面活性剂类细胞ATP释放剂Ec、Es和Et对发光反应的抑制作用,并筛选出以表面活性剂Ec为代表的微生物细胞ATP释放剂。从各类微生物细胞的超薄切片透射电镜观察结果显示,细胞ATP释放剂使微生物细胞的超微结构发生了显著改变,从这些结果推测细胞ATP释放剂改变了细胞壁通透性,穿透细胞壁作用于细胞膜和酶体系,进一步使细胞膜裂解从而有利于胞内小分子物质如ATP的释放。通过优化实验,发现用0.25~0.5 g/L的Ec处理菌液1~2 min时,细胞ATP的释放效果最好。
2、研究ATP生物发光微生物快速检测试剂的反应动力学、反应最适温度、pH以及各种影响因素发现,测试系统中D-荧光素用量为40~50μg/mL时对生物发光反应已经足够;发光反应的最适温度为24℃~25℃,最佳pH为7.2~7.4。保存温度对发光试剂活力的影响非常大,配制好的发光试剂溶液置于4℃保存45 h,可以保持86%的活力,但随着保存温度的升高和时间的延长,酶活力下降较快。各种化学物质如酸、碱、盐及表面活性剂均会抑制ATP发光反应,当NaCl浓度达到1.5 g/L时,可以抑制52.5%的发光。
3、建立起微生物细胞ATP含量与其菌数的相关性。细菌、霉菌孢子和酵母菌细胞的ATP含量分别为0.18×10-16~8.75×10-16g/cell(平均值约2.44×10-16g/cell)、0.68×10-15~6.30×10-15g/cell(平均值约2.47×10-15 g/cell)和0.22×10-14~7.79×1014 g/cell(平均值约1.91×10-14 g/cell),摸索出ATP含量与细菌、霉菌与酵母细胞数量的对应关系。构建起以ATP监测剂和ATP释放剂为主要组成的微生物数量抗干扰快速检测试剂盒,对标准ATP的检测灵敏度可达到1×10-14mol/mL(相当于5×10-12 g/mL),纯培养细菌、酵母和霉菌孢子检测灵敏度分别达104 cells/mL、102 cells/mL和103 cells/mL;发光仪测量值与平板培养计数值在数量级上可达到一致,检测所需时间为15min左右,稳定性及重复性较好。
4、建立了通过滤膜法富集微藻细胞和细菌的饮用水微生物ATP生物发光快速检测方法,30 min内可以完成样品检测,显著缩短检测时间,而且比传统平板法能更客观地反映样品中微生物含量的实际情况,应用在饮用水生产过程控制、产品质量检测及用户饮水机的微生物污染日常监控中,其优势更加突出。
5、采用扫描电镜(SEM)观察生活饮用水生产运行中的BAC材料发现,运行6个月后的BAC己形成相对稳定的微生物类群,大量的杆菌、球杆菌和丝状体附着在其侧面、自然断面,并形成厚厚的生物膜。应用ATP生物发光法测定BAC上生物膜的生物量结果表明,水处理系统运行6个月,反冲洗前50-53cm的BAC样品生物量达到116 pmolATP/g BAC,随着系统运行时间的延长,BAC上生物量继续增加。生物膜的发育在滤池的不同深度具有差异性,最大的ATP浓度位于50-53cm的深度,而且随滤池深度的增加而减少。
6、运用经典的微生物分离培养方法和16S rDNA分子检测技术对BAC生物膜上的微生物类群及其安伞性进行研究,结果表明BAC生物膜上的微生物主要由细菌组成,异养菌的数量达到5.1×106~5.7×108 cfu/g;优势菌属包括食酸菌属(Acidovorax)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)和鞘氨醇单胞菌属(Shingomonas)。虽未检测出水体中常见的致病菌,但应特别注意包括嗜水气单胞菌(Aeromnas hydrophila)、产吲哚金黄杆菌(Chryseobacteriumindologenes)、黄色单胞菌(Flavimonas)、色杆菌(Chromobacterium)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等在内的条件致病菌,因此出厂水的消毒处理显得非常重要。