松花粉醇提物的分离及对3T3-F442A前脂肪细胞增殖、分化的影响

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松花粉被冠有“完全营养库”的美称,破壁的马尾松(Pinus massoniana)花粉中含有多种生命活性物质,具有轻身健体、抗肿瘤、抗氧化、润心肺等诸多功效。虽然有较高的开发价值,但对于松花粉的分离和提取及其成分结构分析方面的研究还亟待补充。本文主要是利用中压液相制备色谱(medium pressure liquid preparation chromatography,MPLC)分离经石油醚提取的马尾松花粉醇提物,利用紫外全波长扫描检测各组分的最大吸收峰波长,通过改变流动相及其比例、流速等条件探究松花粉醇提物的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测条件和中压制备色谱层析分离条件,并进行气相色谱(gas chromatographic,GC)和液相-质谱联用仪(liquid chromatographytandem mass spectrometry, LC-MS)检测。四甲基偶氮唑盐比色法(methylthiazolyltetrazolium,MTT)检测马尾松花粉醇提物对3T3-F442A前脂肪细胞增殖的影响;利用油红O染色技术观察各组分对3T3-F442A前脂肪细胞诱导分化的影响,并进行脂质含量的半定量测定。分别从药物浓度和作用时间两方面, MTT法实验检测所分离的组分C2对人的肝癌细胞HepG2增殖的影响。得到如下结论:一、经石油醚提取的马尾松花粉醇提物的分离纯化条件的探究(1)经石油醚提取的马尾松花粉醇提物A利用硅胶(200目-300目)柱中压分离层析,条件为:检测波长是241.00nm;流动相为正己烷和乙醚(66%:34%);流速为10mL/min。按峰收集,得到B1、B2、B3、B4、B5。利用100%甲醇洗脱,得到组分B0。(2)选择B0进行C18柱(4.6×250mm,5m)高效液相色谱检测,条件为:检测波长是241.00nm、272.00nm;流动相是甲醇和水(9:1);流速为0.5mL/min;进样量是20L。B0组分的中压液相制备色谱分离纯化条件为:柱子填料为C18;检测波长是272.00nm;流速为2.5mL/min;流动相为甲醇和水(9:1);进样量是15mL。B0组分的中压液相制备色谱分离收集条件为:每管2mL,共收集30管记为1-30号,其中1-9号合并记为组分C1,10-20号合并记为组分C2,21-30号合并记为组分C3。(3)对组分C系列进行紫外全波长扫描。C1组分在204.00nm处有最大吸收峰,吸光值为0.831,C2组分在221.00nm处有最大吸收峰,吸光值为2.687,C3组分在207.00nm和290.00nm处有吸收峰,吸光值分别为1.191和0.268,三种组分的最大吸收峰波长有明显差别,结果说明本研究中初步探究得到的利用中压液相制备色谱分离B0的条件是合理可行的。(4)马尾松花粉醇提物C2组分进行高效液相色谱检测的条件是:检测波长为272.00nm、241.00nm,流动相为甲醇和水,流动相分离比是80%甲醇和20%水,流速为0.5mL/min。高效液相色谱检测到在20-25min之间出现两个分离效果较好的峰,据液-质联用分析仪(LC-MS)分析结果推测这两类物质分子量可能是442.2622。对于C2组分中压液相制备色谱分离条件的初步探究结果显示:利用甲醇和水作为流动相,进行梯度洗脱时分离效果较好;检测波长设为241.00nm,流速为2.5mL/min,每2min收一管,共收集30管。其中4-8号管合并记为D1,19-21号管合并记为D2。分别对D组分进行高效液相色谱检测,与C2组分的HPLC结果图对比,D1组分和D2组分的HPLC检测结果图谱有明显的区别,该结果表明本论文中提出的中压梯度分离组分C2是合理的。二、马尾松花粉醇提物对3T3-F442A前脂肪细胞的增殖、分化的影响马尾松花粉醇提物能够促进3T3-F442A前脂肪细胞的增殖,相同浓度的花粉醇提物,随着物质组分的不断分离纯化促进作用越来越弱。马尾松花粉醇提物能够促进3T3-F442A前脂肪细胞的分化,引起前脂肪细胞的形态变化,一定程度上提高了细胞分化率,其中C2的诱导分化作用最强。虽然马尾松花粉醇提物能够促进3T3-F442A前脂肪细胞的增殖和分化,但是与空白对照组相比均无显著性差异。三、马尾松花粉醇提物C2对人肝癌细胞HepG2细胞增殖的影响当马尾松花粉醇提物的C2浓度小于0.01mg/mL时,对肝癌细胞的影响不明显。当浓度在0.01mg/mL-1.00mg/mL时,组分C2能够显著性地抑制肝癌细胞的增殖,其中当浓度为0.5mg/mL时,抑制作用与空白对照组相比有极显著性差异,但是抑制作用随着时间的延长逐渐减弱。
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