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利用有机废弃物（比如木质纤维素）通过厌氧消化生产沼气是能够同时减轻废物处理和能源短缺双重压力的极具吸引力的选择。但是厌氧消化过程即使是在沼气池里也进行的比较缓慢，要想真正应用于生产生物能源就必须要通过不断改进技术和条件来加快速度。沼气的产量首要取决于沼气池中微生物菌群的结构。而这种结构却极其复杂，至今还知之甚少。元基因组fosmid文库的研究技术正好可以进一步对其中微生物群落里大量未知的功能基因进行开发，以期通过微生物工程的方法加快厌氧消化过程，或者用于木质纤维素降解等工业生物技术领域。 为了对沼气发酵，尤其是利用木质纤维素为原料的沼气发酵系统中微生物代谢机制进行更为深入地了解，并开发可用于生物质转化方面的新的酶类，采用本实验室建立起来的相对稳定的以稻草和猪粪为发酵原料的中温发酵沼气池中的沼液为样品，构建了元基因组fosmid文库。从3万个fosmid克隆子中筛选到了131个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。 研究主要包括以下几个部分的内容: 首先发展了一种可用于沼液样品中微生物群落结构多样性解析的免培养技术。基于16S rDNA PCR的变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)被发展并用于对沼液样品中细菌和古菌菌群多样性的研究。相对而言，利用方法1:QIAamp(@)试剂盒抽提得到的DNA纯度较高(A260/280和A260/230的比值)，DGGE图谱的丰富度以及条带亮度较高。垂直梯度凝胶电泳实验结果表明，对细菌菌群而言最佳变性剂梯度是25％-60％，对古菌菌群则是35％-70％。银染Ⅰ:Creste法同时具有较高的灵敏度和较低的背景值。两种沼液样品中的细菌和古菌菌群能够在本研究给出的条件下利用PCR-DGGE进行分析。 为了建立稳定、高效、发酵条件可调控的实验室沼气发酵系统，首先比较了以不同来源的沼液做为接种物在相同发酵条件下的产甲烷效率，随后利用PCR-DGGE和16SrDNA文库测序技术对其中一种产气能力较强的沼液样品中的细菌和古菌菌群结构进行了解析。为了筛选到产气能力较强的沼液做为实验室系统的接种物，从全国各地采集了9种沼液样品，以此作为接种物在相同的实验条件下分别进行了产沼气能力比较实验。结果显示来自崇明县前卫村沼气池的沼液产甲烷能力最强。崇明沼液样品中的细菌和古菌组成通过16S rDNA克隆文库测序得到解析。细菌文库中189克隆被划分为69个OTU，古菌文库中186克隆被划分为25个OTU。沼气池中的优势细菌主要属于厚壁菌门（占总克隆数的47.2％）、拟杆菌门(35.4％)和螺旋体门(13.2％)，而优势古菌主要是伯氏甲烷囊菌(Methanoculleus bourgensis，占总克隆数的29.1％）、巴氏甲烷八迭球菌(Methanosarcinabarkeri,27.4％)和亨氏甲烷螺菌(Methanospirillum hungatei，10.8％)以及甲烷微菌(Methanomicrobiales archaeon，5.4％)等产甲烷菌。沼气池中超过91％的细菌和80％的古菌都是未培养微生物。 以崇明县前卫村的沼液为接种物，以稻草和猪粪作为原料，建立了工作体积为2.0L的实验室沼气发酵系统，温度维持在40±2℃，pH值维持稳定于7.1±0.5。实验室系统的正常平均池容产气率稳定在0.67L/L·d，平均甲烷含量为63.7％，最高能够达到80.3％。DGGE分析结果显示，崇明沼液（接种物）中大部分占优势的细菌和古菌菌群在新的实验室沼气发酵系统中仍然占据优势地位并保持相对稳定。细菌和古菌菌群的结构与原料成分、系统产气速率以及挥发性有机酸(VFA)的含量之间的联系不明显，却和碳源种类密切相关。16S rDNA文库分析结果显示，细菌菌群共有49个OTU,而古菌菌群则只有3个OTU。细菌中占优势的主要是厚壁菌门（占克隆数的78.8％）和拟杆菌门(19.7％)的成员，而古菌则几乎全是甲烷八迭球菌(98.9％)。细菌49个OTU中有13个在沼液样品A的16SrDNA文库中能够找到相近的OTU，而所有的古菌OTU都能够找到非常相近的OTU(98％以上)。以上研究结果显示，一个相对稳定的利用稻草和猪粪产沼气的系统已经在实验室初步建立起来。 最后，以上文所描述沼气系统中的沼液为样品，构建了元基因组fosmid文库，库容量为109440个克隆。文库中插入片段的大小在38-48kb，平均为40kb，库容量约为4377.6Mb。从3万个fosmid克隆子中筛选得到了131个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。Shotgun测序结果显示三个克隆的序列中都能够找到可能编码β-葡萄糖苷酶的基因，而且其中两个的编码产物都与同一个来自芽孢杆菌Bacillus weihenstephanensis KBAB4的β-葡萄糖苷酶最为相近，在氨基酸序列上的一致性均为62％。另一个的编码产物则与来自螺旋菌Leptospira biflexa serovar Patoc strainPatoc1(Paris)推测的alpha-葡萄糖苷酶最为相近，在氨基酸序列上的一致性为43％。这说明通过元基因组fosmid文库技术有望发现新工业用酶的基因，并有望进一步解析厌氧发酵产沼气过程中微生物代谢机制的多样性。