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背景：阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是最常见的老年痴呆疾病。晚期患者通常需要照料才能维持生活，为社会和经济经带来了巨大的负担。越来越多的证据显示，AD是一种突触衰竭（ synaptic failure）疾病。已经发现与钙通道相关的钙调节异常与 AD的突触功能障碍和病理改变相关，而突触功能异常又与认知功能衰退有关。因此，深入研究钙通道的分子调节机制如何参与了 AD的病理生理过程对治疗AD具有重要意义。 L型钙通道（L-type calcium channel，LTCC）是调节钙离子(Ca2+)进入细胞内的主要途径。主要由是由α1、β、γ、α2/δ五个亚单位构成。其中钙离子通道α1亚基（Cav1.1-1.4）是主要的功能单位，它构成钙离子传导的孔道，电压感受器和门控调节装置，能单独发挥钙通道的功能，也是许多药物的作用部位基因。哺乳动物的大脑，主要表达Cav1.2和Cav1.3两种亚型，有研究表明，在AD鼠中，星形胶质细胞高表达 Cav1.2，可能和 Aβ的形成有关。钙通道介导的钙内流在突触可塑性起着关键性作用，已经发现与钙通道相关的钙调节异常与 AD的突触功能障碍和病理改变相关。研究显示，在突触重塑中，AC起着积极主动的作用。因此，研究AC上的钙通道对AD的治疗有重要意义。 LTCC的阻断剂逆转了Aβ所致的LTP损害。但直接阻断LTCC,可能干扰了正常的细胞内钙稳定和学习记忆功能。精细调控LTCC，而不是直接阻断，是治疗AD的另一策略。越来越多的研究显示，E2在不同类型的神经炎症性及神经退行性病变中所起的神经保护作用均与细胞内的钙平衡有关，它具有明显的调节细胞内钙稳定的作用，并能调控 LTCC的功能。星型胶质细胞同样表达 ER，同神经元一样，是E2潜在的调节靶点。然而，是否E2调节星型胶质细胞中Cav1.2的表达，目前仍不清楚。 目的：通过体外培养原代星形胶质细胞，探索E2对星形胶质细胞Cav1.2的调控机制，了解在Aβ等神经炎症样病理条件下，E2对Cav1.2的调节作用是否有所改变，以及验证Cav1.2在 E2对学习和记忆中的影响，以期寻找针对AD的新药物靶点。 方法：通过酶消法及摇床振摇法纯化星形胶质细胞，建立稳定的原代星型胶质细胞培养模型，并经免疫荧光（Immunofluorescence，IF）的方法鉴定星形胶质细胞的纯度。采用免疫印迹（Western blot，WB）方法进行E2及ER亚型介导的Cav1.2蛋白表达的调节作用。通过反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测Cav1.2 mRNA水平，使用转录水平抑制剂放线菌素D(Actinomycin D，Atc-D)以及蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide，CHX）观察E2对基因表达的效果。为了了解Cav1.2的蛋白降解途径以及E2对其途径可能的影响，分别运用了泛素化抑制剂MG132及溶酶体抑制剂氯喹（Choloroquine，CQ）。Aβ、H2O2、LPS三者能刺激星型胶质细胞的活化，应用WB检测了，上述炎症情况下，E2对Cav1.2表达的影响。在动物模型试验中，我们选用了APP/PS1转基因小鼠为实验对象，并建立了卵巢切除（Ovariectomize，OVX）小鼠模型，皮下注射参与调节Cav1.2的ER，运用免疫组化的方法，检测了脑内tau蛋白的磷酸化水平，并选择了条件恐惧实验，进一步了解雌激素对 AD的防治是否具有重要意义。 结果：实验证明 E2呈浓度依赖的方式上调了星型胶质细胞的Cav1.2蛋白的表达，且该上调作用能被雌激素受体（ER）拮抗剂ICI-182,780阻断。选择性雌激素α受体（ERα）激动剂PPT和择性雌激素β受体（ERβ）激动剂DPN均上调了星型胶质细胞中Cav1.2蛋白的表达，两者的作用同样成浓度依赖的方式；其中，PPT上调 Cav1.2的作用与 E2上调 Cav1.2的作用类似。进一步研究发现，E2未改变Cav1.2的mRNA水平；同时，E2上调的Cav1.2蛋白表达被放线菌酮（CHX）而不是被放线菌素（Atc-D）抑制,提示E2调节Cav1.2蛋白的表达发生在转录后水平。我们还发现，E2可能是通过减慢Cav1.2蛋白的泛素化降解率从而增加其表达。分别给予不同的神经炎症样刺激因素Aβ, H2O2, LPS，均增加了Cav1.2的表达，然而，加用E2后，这种上调的作用被抑制。E2对通过 ERα的介导上调了 Cav1.2，然而在有炎症因素刺激的情况下，E2发挥了协调抑制作用，拮抗了由Aβ, H2O2上调的Cav1.2的作用，这可能系雌激素对神经系统病变起保护作用的一种可能的机制。然而，这种协调抑制作用在LPS组中未出现，考虑LPS上调Cav1.2可能有着和E2不一样的调节机制。 在AD脑中,tau蛋白呈现过度磷酸化,从微管上解离,由可溶性的tau蛋白变为不溶性的tau蛋白,进而形成双螺旋状或直的神经原纤维,导致神经原纤维缠结。研究证实 A C激活在 A D中 tau蛋白病变的形成和发展上具有决定性的意义,可以加重AD的神经原纤维缠结。我们已经在离体实验中证明，PPT对Aβ上调 Cav1.2的表达有拮抗作用，故在动物实验中，选用APP/PS1转基因小鼠，建立 OVX模型，检测了 PPT对 tau磷酸化的作用，结果显示，经 PPT干预后能有效逆转AD小鼠海马CA3区的tau262过度磷酸化水平，我们推测这种逆转作用，可能AC也有积极参与。在研究E2及ER对学习记忆影响的实验中，我们利用了敏感度比较高的条件恐惧实验，但可能样本数量较少可能性大，该部分提示为阴性结果。进一步我们需加大样本量进行重复实验。 结论：E2以ERα介导为主的方式，上调了AC的Cav1.2的表达，E2上调Cav1.2的作用可能发生在转录后水平。泛素化及溶酶体途径均参与了Cav1.2的降解，其中，E2可能通过减慢Cav1.2蛋白的泛素化降解率从而增加其表达。E2拮抗了Aβ和H2O2上调的Cav1.2的作用，逆转了AD小鼠海马CA3区的tau的磷酸化水平。这些研究结果将为AD替代策略提供基础。