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艾美耳球虫（Eimeria）是一类专性胞内寄生性顶复门原虫，可以严重危害集约化养鸡业生产。目前，鸡球虫病的主要防治手段是药物和活卵囊疫苗，但二者都存在不可逾越的障碍，这就需要寻求鸡球虫疫苗发展的新方向。 本试验为了研究鸡球虫基因工程疫苗，以致病力最强的柔嫩艾美耳球虫为研究对象，选取其四个关键的入侵相关蛋白分子（顶膜抗原及棒状体颈部蛋白），利用生物信息学分析其关键功能结构域，利用重叠延伸PCR技术连接功能结构域的表达基因，将其嵌合为一个多表位的抗原，对该嵌合抗原进行真核表达质粒构建，制备DNA疫苗，并对其免疫保护效果进行评价分析。 首先利用生物信息学与比较基因组学技术，注释拼接到柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)入侵相关蛋白（EtAMA1，EtMA1，EtMA2和EtRON2）的基因序列，以预测的序列设计引物，以E.tenella（广东株）第二代裂殖子总RNA为模板，用PCR方法扩增出这四种基因的开放阅读框(ORF)序列;通过在线软件，对其进行生物信息学分析;再分别设计引物，从这四种基因的全长序列中扩增胞外区的DⅡ结构域，并通过SOEPCR技术将其构建成一个可串联表达的嵌合抗原基因片段，其大小为1452bp，编码484个氨基酸，其编码的蛋白质分子量为50.84KD，等电点为8.26。 将嵌合抗原CA片段插入到真核表达载体pVAXⅠ中，构建真核重组质粒。将所构建的pVAXⅠ-CA重组质粒瞬时转染239T细胞，同时肌肉注射鸡左腿，检测其体内外表达情况，结果表明该重组质粒在真核细胞及鸡体内均有转录;通过RealTimePCR对质粒免疫机体后3d、6d和10d的肌肉组织RNA进行转录水平差异检测显示，CA在免疫后6d转录水平最高。 将真核质粒pVAXⅠ-CA作为DNA疫苗对鸡体进行免疫，分析评价其免疫保护效果。将150只3日龄鸡，分为6组，设低中高三个剂量组、空载体对照组、感染非免疫组、非感染非免疫组，在3日龄和10日龄进行一免和二免，二免后10d经口感染5×104个新鲜孢子化卵囊，感染后7d扑杀试验鸡，评价抗球虫指数。利用RealTimePCR对免疫前、一免后、二免后鸡的IFN-γ、IL-2和IL-12的转录水平进行检测。结果显示:免疫组的ACI值均高于对照组，说明pVAXⅠ-CA起到了抗球虫感染的作用;IL-2、IL-12和IFN-γ在鸡3日龄免疫前表达量都很低，免疫后免疫组的细胞因子表达量均高于对照组，表明嵌合抗原CA可以诱导机体产生细胞因子，激发机体产生抗球虫细胞免疫反应;结合ACI值与细胞因子评价显示:高剂量（100μg）的质粒可以诱导更为持久的细胞因子产生，起到更好的抗球虫效果。 本研究首次将E.tenella四个关键入侵相关蛋白分子的功能结构域编码基因串联在一起，构建成一个新的嵌合抗原，发现该嵌合抗原对球虫感染具有免疫保护作用，并且会诱导相应的细胞因子产生，为新型抗球虫疫苗及其免疫程序的研究提供了理论基础和新思路。