三角梅核糖体失活蛋白基因多态性的研究及遗传转化

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核糖体失活蛋白(RibosomeInactivitingProtein,RIP),是广泛存在于植物界中的一类毒蛋白,它具有N-糖苷酶活性,能够对哺乳动物核糖体大亚基上的28SrRNA进行脱嘌呤作用,从而破坏核糖体的结构,抑制蛋白质的生物合成。RIPs根据一级结构的不同一般分为3种类型:Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型,由一条多肽链组成;Ⅱ型,是双链蛋白;Ⅲ型,先合成无活性的前体,经酶解加工后成为有活性的RIP。   RIP的定义源自最初发现ricin能使核糖体失活、蛋白质生物合成受到抑制的毒性机理,而且由于其对肿瘤细胞的毒性大于对正常细胞的毒性而受到重视,带动了RIP研究的进展。研究表明RIP不仅具有N-糖苷酶活性,而且具有核酸酶活性和其他多种酶活性;而且,除了肿瘤细胞之外,人们还发现了RIP对包括HIV病毒在内的多种动物病毒的毒性,以及对多种植物病毒(如烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV、马铃薯X病毒PVX、马铃薯Y病毒PVY)、植物真菌病害(如立枯病、白粉病、灰霉病等)及昆虫(如烟草天蛾,稻飞虱,棉铃虫)等的抗性。因此,RIP在医学和农业上应用潜力巨大。   1997年Bolognesi等首先从红花三角梅BougainvilleaspectabilisWilld中分离到一种核糖体失活蛋白,命名为Bouganin蛋白;研究表明Bouganin属于Ⅰ型RIPs,它不仅具有N-糖苷酶活性,而且它的一个显著特征是其对动物细胞或动物个体毒性非常低,是目前所发现的毒性最低的一种核糖体失活蛋白。   本研究以厦门本地品种光叶三角梅B.glabra为材料,根据同源序列设计特异性引物扩增其核糖体失活蛋白基因序列。研究表明B.glabra中bouganin基因具有非常高的多态性,本研究先后扩增得到14条bouganin同源序列,并通过race技术获得了bouganin基因的5’和3’非翻译区段。主要结论如下:   1.14条bouganin序列长度除了bou11为690bp外,其余均在852~957bp之间,通过序列比对表明各个序列之间的相似性在85%~99%之间。各个序列与报道的bouganin序列相似性在78%~82%之间。   2.通过对bouganin基因的3’和5’末端非编码序列的分析发现,bouganin基因3’末端序列存在较高的多态性,而其5’末端序列却表现出高度的一致性。   3.预测其氨基酸二级和空间结构发现,虽然14条bouganin的DNA和氨基酸序列有明显的不同,但其空间结构却没有明显的差异。   此外,本研究选取了多态性片段中的多个片段构建了植物转化载体并进行了番茄转基因的研究。目前已经获得转基因苗,并拟对转基因苗的抗病虫特性进行进一步分析。这项工作希望了解bouganin基因的抗植物病虫害的功能,并为三角梅RIPs基因在农业抗病虫害上的应用研究提供一定的基础和依据。
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