论文部分内容阅读
细胞色素P450芳香化酶(aromatase)可以催化某些雄激素(如睾酮和雄烯二酮)转化为雌激素,是类固醇激素代谢中的一种重要酶类,广泛存在与大多数脊椎动物的脑和性腺中。在鱼类,至少发现了由两种不同基因编码的P450arom,分别来自性腺(Cyp19a1a)和脑(Cyp19a1b)。这两种芳香化酶具有特异性的启动子和不同的组织分布,表达受不同调节因子影响,分别具有独特的功能。
本研究在实验室前期工作的基础上,从已建立的赤点石斑鱼卵巢SMARTcDNA文库中克隆了赤点石斑鱼卵型芳香化酶基因(EaCyp19a1a),并制备了特异性多克隆抗体,对其在成鱼体内的表达特征和调控机制进行了研究。
氨基酸序列同源性分析发现,EaCyp19a1a基因具有芳香化酶共有的保守区域,在进化中高度保守。其序列与鱼类卵型芳香化酶之间的同源性较高,达90%以上,并且存在一些特异保守的氨基酸残基。
赤点石斑鱼作为雌雄同体雌性先熟的鱼类,在其发育过程中性腺可以由卵巢经过雌雄共存期向精巢发生转变。本研究经Western blot检测发现,在赤点石斑鱼成鱼组织中,EaCyp19a1a在卵巢组织特异表达。在人工性反转过程中,EaCyp19a1a表达量随着性腺由雌到雄的转变逐渐下降,在雄性精巢组织中检测不到表达。免疫荧光定位结果显示,EaCyp19a1a仅表达于卵巢滤泡细胞中,并且随着性反转过程中滤泡细胞的退化而由强变弱。
本研究还克隆分离了EaCyp19a1a启动子区域,用于研究其表达调控机制。序列分析发现,其上有包括SF-1、CREB、SOX5等在内的27个潜在转录因子结合位点。启动子5端缺失系列荧光素酶报告载体瞬时转染实验表明,在-1010到-898片段中的CREB转录因子对EaCyp19a1a启动子活性增强具有非常重要的顺势调控作用,而-1216到-1010片段中的GATA和SOX5转录因子则可能是启动子活性的抑制子。
本研究还构建了启动子绿色荧光蛋白表达载体用于在体研究EaCyp19a1a启动子的调控作用。通过显微注射斑马鱼受精卵,发现绿色荧光蛋白在斑马鱼早期性腺中特异表达,这表明EaCyp19a1a启动子序列中含有调控性腺特异表达的顺势作用元件,对EaCyp19a1a卵巢特异表达有调控作用。
本研究利用序列分析,还发现部分硬骨鱼类Cyp19a1a基因启动子近端有一段长约300bp的高度保守区域,与EaCyp19a1a启动子的序列同源性最高达93%,部分转录因子结合位点如TATA框、SF-1、SOX5和CREB等也在该区域保守存在。鉴于人类Cyp19基因的相关研究,我们推测该区域对鱼类Cyp19a1a卵巢特异表达具有重要意义。