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MerTK是一种受体型蛋白酪氨酸激酶,与Tyro3和Axl基因具有相似的结构,同属Tyro3亚家族,统称“TAM基因”,在多种系统中发挥着重要的细胞生长调控和生理作用。TAM基因在生殖、免疫、神经等系统中对多种细胞的生长和生理活动有直接的调控功能,表现为多方面的:(1)TAM基因敲除可以引起中枢神经系统的多区域多巴胺神经元凋亡,与人类老年性神经退行性病变的病理特征基本接近。(2)MerTK突变导致视网膜色素上皮细胞(Retina pigment epithelium,RPE)吞噬视杆细胞外节盘膜功能异常,出现视网膜色素变性疾病。(3)巨噬细胞吞噬凋亡的淋巴细胞功能异常,出现自身免疫性疾病。(4)睾丸滋养细胞吞噬废弃的精母细胞碎片的功能异常,出现精子发育障碍。因此MerTK介导的细胞吞噬功能异常可能成为很多疾病的病因机制。
MerTK介导的吞噬功能障碍的疾病模型首先在视网膜色素变性中得到证实。MerTK敲除的成年鼠出现视网膜全层的退行性病变,视网膜色素上皮细胞的吞噬异常:光感受器与内核层的神经元大量凋亡。光感受器与其外层的视网膜色素上皮细胞微绒毛之间的空隙中堆积大量的代谢脱落的光感受器外节盘膜(Photoreceptor outer segment,POS),视网膜最外层的色素上皮也发生退行性变,呈现与人类的视网膜色素变性极其相似的病变。MerTK敲除鼠的视网膜病理变化与1962年Dowling等人发现的Royal College Surgeons(RCS)大鼠的视网膜病变一致,RCS大鼠的表型具有遗传性。直到2000年,DCruz等人报告了在RCS大鼠的基因组中发现了MerTK的突变体。在此基础上,Gal等人在328例视网膜色素变性患者中发现有3例患者有MerTK突变,并将人类MerTK定位于染色体的2q14.1位区。综合这些研究成果:MerTK基因被公认为视网膜色素变性的致病基因之二。
视网膜色素变性是眼科最常见的遗传性视网膜退行性病变之一,主要表现为色素上皮吞噬功能障碍和视网膜神经细胞进行性凋亡,但是对于MerTK调控吞噬过程的环节和机制都不清楚,视网膜神经细胞凋亡是否由MerTK突变直接引起,还是继发于视网膜色素上皮异常引起的也没有任何报道。针对视网膜变性的病因靶点不清楚,成为开发对因治疗方法的主要瓶颈问题。临床目前没有任何有效的治疗视网膜色素变性的方法。但是近年来有报道显示神经生长因子(Neuron growth factor,NGF)在RCS大鼠中可以延缓视网膜变性的进程,临床医师也曾尝试使用NGF治疗视网膜色素变性病人,但是在临床的治疗效果说法不一,多数人对临床使用NGF治疗视网膜色素变性的效果并不认可。
研究目的:
确定MerTK突变引起视网膜退行性变的作用靶点,并探讨其发病机制,为寻找MerTK突变引起的视网膜色素变性寻找治疗靶点提供实验依据。
材料和方法:
1.MerTK突变导致的视网膜退行性交表现为大量神经细胞死亡,对于MerTK是否直接调控神经细胞生长还是未解的问题。为了排除色素上皮细胞对神经细胞生长带来的影响,本课题将视网膜神经细胞进行体外培养,并给予NGF刺激神经元加速生长,来观察MerTK突变对神经细胞生长的作用。野生型和MerTK敲除型小鼠的视网膜经过胰蛋白酶酶解后,进行体外培养,分为未处理组、NGF(10、20、30ng/ml)的处理组,观察神经细胞生长状态,评价MerTK突变对神经细胞生长的影响。
2.因为MerTK调控的细胞吞噬作用在细胞水平属于同一机制,本实验将使用视网膜色素上皮细胞和巨噬细胞共同来研究MerTK对吞噬过程的调控环节。将取自野生型和MerTK敲除型的小鼠RPE和巨噬细胞分别进行体外原代培养,制作吞噬模型,在不同时间点观察吞噬过程不同阶段的形态学演化过程。
a)向体外培养RPE中加入视杆细胞外节盘膜,制作RPE的吞噬模型。分别在不同的时间点:0,2,4小时用多聚甲醛固定吞噬中的细胞。分别进行MerTK和细胞骨架的微丝肌动蛋白和α-微管蛋白进行免疫荧光双重染色,在激光共聚焦显微镜下观察吞噬过程中吞噬体的形成形态,探讨MerTK突变导致的吞噬障碍的发生环节。
b)向巨噬细胞中加入凋亡的淋巴细胞。分别在不同的时间点:0,20,40分钟用多聚甲醛固定吞噬中的细胞。分别进行MerTK和细胞骨架蛋白--微丝肌动蛋白和α-微管蛋白进行共定位免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察吞噬过程中吞噬体的形成形态。
实验结果:
1.对比野生型和MerTK-/-型小鼠视网膜神经细胞体外混合培养,并给予NGF的刺激神经元生长,观察视网膜神经元的生长在野生型与MerTK敲除鼠之间没有差异,即使给予NGF的刺激,二者的神经元生长状态也没有明显差异。
2.体外培养的原代RPE和巨噬细胞都出现吞噬作用的内吞能力下降,主要表现为被吞噬的结构进入吞噬细胞内的量减少。
3.经过对细胞骨架微丝肌动蛋白免疫荧光标记结果显示:吞噬启动后,细胞内的微丝肌动蛋白出现向吞噬体粘附点极化聚集的现象,并向细胞外伸展包裹吞噬体形成吞噬体,在吞噬体周围与MerTK信号融合共定位。MerTK敲除后,肌动蛋白的多聚化过程受阻,不能形成吞噬体,不能完成吞噬作用。
4.经过对细胞骨架α-微管蛋白免疫荧光标记结果显示:静态时微管蛋白处于细胞核周围的生发中心聚集,在吞噬启动后,细胞内的α-微管蛋白出现自生发中心向吞噬体粘附点极化聚集的现象,附着在吞噬体底部,并且与MerTK的信号出现共定位。MerTK敲除后,α-微管蛋白的仍然可以在吞噬体处形成聚集,但是与肌动蛋白没有共定位。
结论:
MerTK基因可能直接调控微丝肌动蛋白和微管蛋白的多聚化过程而调控的视网膜色素上皮细胞吞噬作用。MerTK突变可以导致RPE的吞噬功能障碍,细胞骨架蛋白重塑受阻,不能形成吞噬体。视网膜神经细胞生长不受MerTK突变的影响,其退行性病变可能是继发于RPE失功能所致。