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植物化学物是当今国际癌症防治研究领域的前沿。溃疡型结肠炎经过长时间反复发作有发展成大肠癌的危险,目前尚没有很好的预防控制措施。白藜芦醇(Resveratrol Rev)是一种具有多种潜在的健康促进功效的植物化学物,广泛存在于多种药食性植物中。本项目选用体外细胞实验和体内动物实验相结合的试验系统对Rev抗炎和抗炎性肿瘤作用进行了研究。其中体外实验中观察了不同浓度的Rev对结肠癌细胞Ht-29生长的影响,并测定细胞COX-2、Bcl-2和Bax的表达以初步探讨其作用机制;动物实验分别以DSS(硫酸葡聚糖钠)和DMH(二甲基肼)+DSS建立小鼠溃疡型结肠炎和炎性大肠癌模型,观察不同浓度的Rev对上两种动物模型的作用,并完成所选指标的测定以进行作用机制的探索。因而本研究能为Rev在炎症和肿瘤防治研究中的应用提供一定的科学依据,为进一步开发和利用天然植物中的Rev提供参考。
I.白藜芦醇对实验小鼠溃疡型结肠炎作用的研究
目的:研究Rev对小鼠溃疡型结肠炎的作用。
方法:以Balb/C小鼠为实验对象,随机分为5组,即正常对照组、溃疡型结肠炎模型对照组、Rev低剂量组、Rev中剂量组和Rev高剂量组,其中正常对照组的实验动物于整个试验过程中正常饲养,模型对照组的实验动物接受1个循环的DSS(即实验小鼠先饮用7天含5%DSS的饮用水后,再饮用14天不含DSS的普通动物饮用水)以建立溃疡型结肠炎模型,而三个Rev处理组除了以同样方式接受一个循环的DSS以外,每天还经灌胃分别给予10mg/kgbw(低剂量组)、30mg/kgbw(中剂量组)、90mg/kgbw(高剂量组)的Rev。所有动物除了接受相应的处理外,均正常喂养直至实验末,整个试验共持续28天。于试验末进行动物宰杀,并完成炎症病理学计分、NF-κB、COX-2、iNOS、SOD、GSH-PX、TAOC以及血清中IL-1β和TNF-α水平的测定。
结果:与正常对照组比较,模型对照组和Rev处理组试验动物均不同程度地出现了溃疡型结肠炎的症状和病理改变。而与模型对照组相比,三个Rev处理组试验动物溃疡型结肠炎炎症的严重程度呈减轻趋势,其中Rev中、高剂量组炎症明显减轻(p<0.05)。指标检测结果可见,同模型对照组相比,三个Rev处理组试验动物血清和肠粘膜中TAOC水平呈升高趋势,肠粘膜组织中COX-2和iNOS的表达水平明显下降,且与Rev剂量具有一定的相关性。结论:Rev具有一定的抗溃疡型结肠炎的作用,其机制与Rev能提高机体血清和肠粘膜中的抗氧化能力、抑制机体肠粘膜中COX-2和iNOS的表达有关。
Ⅱ.白藜芦醇对炎性大肠癌作用的研究
一、体外试验
目的:观察Rev对大肠癌细胞Ht-29生长的影响。
方法:选用人大肠癌细胞系Ht-29,在体外培养的情况下,Rev处理组分别以含有12.5、25、50、100μMRev的培养液培养,对照组则以不含Rev的正常培养液培养,检测指标及方法包括:
●肿瘤细胞生长情况(MTT法);
●细胞COX-2水平的测定(细胞Western blotting法);
●细胞Bcl-2和Bax的表达(免疫细胞化学法)。
结果:与对照组相比,Rev能够抑制HT-29细胞的生长,且有一定的剂量和时间依赖性。以不同浓度的Rev作用HT-29细胞48h后发现,Rev对细胞内Bcl-2的表达水平没有明显影响,但50和100μmol/L的Rev能够明显抑制细胞内COX-2的表达,并且100μmol/L的Rev能够明显上调细胞内Bax的表达。结论:Rev能够抑制结肠癌细胞HT-29的增殖,且有一定的剂量和时间依赖性,其作用机制与Rev能够抑制细胞内COX-2的表达以及上调胞内Bax的表达有关。
二、动物实验研究
目的:研究Rev对实验小鼠炎性大肠癌的作用。
方法:以Balb/C小鼠为实验对象,随机分为5组,即正常对照组、炎性大肠癌模型对照组、Rev低剂量组、Rev中剂量组和Rev高剂量组,其中正常对照组的实验动物于整个试验过程中正常饲养,模型对照组的实验动物先经腹腔一次性高剂量地注射30mg/kgbw的DMH,一周后接受3个循环的DSS(每一循环为实验小鼠先饮用7天含3%DSS的饮用水后,再饮用14天不含DSS的普通动物饮用水),建立炎性大肠癌模型,而Rev实验组除了以同样方式接受DMH+DSS以外,每天还经灌胃分别给予10mg/kgbw(低剂量组)、30mg/kgbw(中剂量组)、90mg/kgbw(高剂量组)的Rev。所有动物除了接受相应的处理外,均正常喂养直至实验末,整个试验共持续77天。于试验末进行动物宰杀,并完成癌症病理学计分、SOD、GSH-PX、TAOC、NF-κB、COX-2、iNOS、VEGF、Bcl-2、Bax以及血清中IL-iβ和TNF-α水平的测定。
结果:与正常对照组相比,模型对照组和三个Rev处理组试验动物均不同程度地出现了大肠多发性恶性增生/腺瘤/癌症。而与模型对照组相比,三个Rev处理组试验动物恶性增生/腺瘤/癌症发生率和多发数呈降低趋势,其中恶性增生/腺瘤/癌症发生率由模型对照组的86.67%分别下降到80%、60%和66.67%,而恶性增生/腺瘤/癌症多发数则由模型对照组的3.08个肿瘤/试验小鼠分别下降到2.83、2.56和1.80个肿瘤/试验小鼠。指标检测结果可见,同模型对照组相比,三个Rev处理组试验动物血清和肠粘膜中TAOC明显地升高,而其肠粘膜组织中COX-2和iNOS的水平明显下降,且有一定的剂量相关性;Rev中、高剂量组试验动物血清中TNF-α水平明显下降。
结论:Rev具有一定的抗炎性大肠恶性增生和炎性大肠癌作用,其机制与Rev能提高机体血清和肠粘膜中的抗氧化能力、抑制血清中TNF-α以及肠粘膜组织中COX-2和iNOS的表达有关。