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薯蓣皂甙元作为合成甾体激素药物的重要中间体,广泛应用于消炎镇痛、脑血管、避孕药物的合成。工业生产中,皂甙元一般通过强酸在高温高压下直接水解盾叶薯蓣根茎制得。该方法产生大量的高COD,高硫酸盐,高色度的强酸性废水,非常难处理,严重污染当地环境。与酸水解相比,生物催化反应条件温和、专一性强,是一种环境友好的方法。利用微生物或酶水解盾叶薯蓣制备薯蓣皂甙元已有报道。但是酶法成本较高,不适宜工业化生产;微生物方法可以解决成本问题,效率却不高。所以提高盾叶薯蓣皂苷微生物水解效率对彻底解决皂甙元生产过程中产生的污染问题有非常重要的意义。
本课题通过原料预处理,菌种驯化筛选,发酵条件优化开发出一套微生物高效转化盾叶薯蓣皂苷的新方法——“酶预处理—微生物水解法”。该工艺由两部分组成,第一部分利用淀粉酶和糖化酶分离原料中的淀粉,第二部分利用微生物水解糖渣中的皂苷制备薯蓣皂甙元。在此基础上分析皂苷转化途径,分离纯化关键皂苷糖苷酶,研究微生物水解机理,为进一步实现酶系代谢调控奠定基础。
对酶预处理和微生物水解两个阶段工艺参数进行了优化。在最佳工艺条件下,酶法可以分离原料中98.0％淀粉,回收24.0%还原糖,通过预处理可以将皂苷从淀粉的包裹中释放出来,皂苷含量提高了9.90%。微生物转化阶段,选择了水解效率最高的里氏木霉(Trichoderma reesei)作为实验菌种。通过响应面曲面法优化摇瓶发酵过程中培养基成分(碳源、氮源、无机盐、表面活性剂)和条件(pH值,底物浓度,温度,发酵时间)及放大实验中5.0 L发酵罐的搅拌速率和通气量。在优化的条件下,薯蓣皂甙元得率可以达到90.2%,产品质量与传统工艺一致。新工艺可以降低生产废水中99.4%COD,100%SO42-和100%酸。与直接微生物水解相比,酶预处理—微生物水解法产品得率提高了42.4%。该工艺为薯蓣皂甙元的清洁生产提供了一种经济高效的新方法。
从皂苷水解途径和关键糖苷酶分离纯化及性质研究两个方面探讨了微生物水解盾叶薯蓣皂苷的机理。酶预处理后的原料中共分离出4种主要甾体皂苷,以其为底物的单体转化模型实验表明,T.reesei转化皂苷时,皂苷C3位糖链上的糖基由末端开始逐个水解,最后生成薯蓣皂甙元,此过程中主要副产物是薯蓣皂甙元葡萄糖苷。
T.reesei水解盾叶薯蓣皂苷涉及到多种皂苷糖苷酶的作用,能检测到的有5种β-糖苷酶和2种既具有α-糖苷酶活性又具有β-糖苷酶活性的水解酶。利用Native-Page纯化得到四个电泳纯糖苷酶。其中E1,E4只具有β-糖苷酶活性,可以水解皂苷C26位β-葡萄糖和C3位糖链末端β-葡萄糖。E2,E3既具有β-糖苷酶活性,又具有α-糖苷酶活性。可以水解皂苷C26位β-葡萄糖,C3位糖链末端β-葡萄糖、α-鼠李糖及C3位β-葡萄糖,在盾叶薯蓣皂苷的转化中扮演重要角色。经MALDI-TOF/TOF测定确定E1,E3,E4分别与三种假定蛋白具有较高的同源性,E2与一种麦芽糖酶具有较高的同源性。
基于清洁生产和资源综合利用的理念,本论文研发了从盾叶薯蓣中提取薯蓣皂甙元的新工艺——“酶预处理—微生物水解法”,并优化了各阶段工艺参数。一方面合理利用了盾叶薯蓣中的有用成份,另一方面提高了微生物水解法生产薯蓣皂甙元的效率。此外探讨了微生物水解过程中皂苷的转化途径,并系统分析了水解体系中皂苷糖苷酶系组成,为后续通过构建基因工程菌实现糖苷酶系调控以进一步提高微生物水解效率奠定基础。