论文部分内容阅读
研究背景：
支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，轻度儿童哮喘的多数能控制良好，中重度哮喘部分难以控制，其机制不明，因此深入研究中重度儿童哮喘的炎症机制有望改善其疗效。哮喘发病过程中气道重塑是其中特征性表现，既往认为参与气道重塑的炎症细胞以嗜酸性粒细胞为主，现已有研究发现支气管哮喘诱导痰中其它炎性细胞如中性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、巨噬细胞比例明显增高，其中以中性粒细胞炎性反应最多。
迄今为止，支气管哮喘慢性炎症、气道重塑的细胞机制尚未完全清楚。辅助性T细胞(helper T lymphocyte，Th)1/Th2平衡理论及白介素5(interleukin—5，IL—5)驱动的嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)气道炎症学说占据主导地位，近年发现EOS炎症理论无法解释一些重症哮喘病理现象，并有资料显示辅助性T细胞如Th17及中性粒细胞可能参与了哮喘的慢性炎症过程。
过度活化的Th2细胞产生的IL—5引起嗜酸性粒细胞的活化、趋化，嗜酸性粒细胞能合成和分泌大量的细胞毒素及促炎性介质，引起一系列的组织损伤，如上皮细胞的缺损，血浆外渗，气道高反应性及组织炎症的启动和维持，最终导致肺功能的紊乱和缺失，但在NEA亚型中IL—5作用如何尚无报道。
IL-17于1995年首先从CD4+T文库中克隆，多种细胞均可产生IL-17，但主要还是来源于Th17。IL-17的主要生物学功能是介导中性粒细胞促进炎性反应，与类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病和移植排斥反应密切相关。动物实验及体外实验显示，Th17活化后产生IL-17，在粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G—CSF)的共同作用下诱导骨髓CD34+干细胞分化成中性粒细胞，刺激中性粒细胞活化、聚集至气道，并抑制中性粒细胞凋亡。中性粒细胞可产生弹性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)、蛋白水解酶—3(caspase—3)、基质金属蛋白酶—9(Matrix Metalloproteinase9，MMP—9)、转化生长因子—β(transforming growth factor—β，TGF—β)等介质，参与气道及肺组织的损伤和纤维化。
中性粒细胞与Th17在支气管哮喘发病中的作用机制仍未研究清楚，Th-17作为CD4+T细胞调节中性粒细胞参与哮喘发病的中介备受关注，有研究报道成人哮喘患者体内的IL-17水平明显高于正常人。另有资料显示以中性粒细胞炎症为主的哮喘对目前以吸入性糖皮质激素(inhaled corticosteroids，ICS)为主的联合治疗效果差，深入研究中性粒细胞及Th17在儿童中重度哮喘中的作用，可望为难治性哮喘寻求新的治疗靶点。
最近有研究通过胸部高分辨CT(high—resolution computed tomography，HRCT)检查测定成人气道壁面积和厚度，结果显示哮喘患者气道壁厚度、气道壁面积与气道总截面积之比明显高于健康对照者，哮喘患者的支气管壁厚度与病情严重度成正相关。作为无创性检查，高分辨CT用于儿童哮喘的气道重塑评估，国内尚无报道。
研究目的：
1.通过对哮喘患儿痰液及血液的研究了解IL—5及IL-17在儿童中重度哮喘中的作用；
2.探讨HRCT用于评估哮喘儿童气道重塑情况的可能性。
研究对象与方法：
1.研究对象
选择中重度支气管哮喘患儿65例，其中急性发作期哮喘患儿为45例，缓解期哮喘患儿为20例，20例缓解期患儿均经正规联合治疗达到临床缓解。急性发作期按诱导痰的细胞分类分为嗜酸细胞性哮喘(eosinophilic asthma，EA)组25例及非嗜酸细胞性哮喘(non—eosinophilic asthma，NEA)组20例。该组患者按儿童哮喘严重度分级均属于三、四级患儿，分为中度持续组20例；重度持续组25例。临床缓解期患儿按诱导痰的细胞分类分为嗜酸细胞性哮喘组10例及非嗜酸细胞性哮喘组10例。选取8例病程较长的病人于其临床缓解期行胸部高分辨CT，8例患者病程范围为3～8年，病程中位数为4.5年。
同期健康儿童20例设为正常对照者。经统计分析，两组男女比例、年龄均存在可比性。
2.研究方法
2.1诱导痰的采集、处理：由喷射式雾化仪吸入3％高张盐水10～15min，将咳出的痰液收集至约1ml，取粘稠部分痰液加入适量的裂解液(0.1％DTT)，混匀后水浴并振荡十分钟；将痰液用40μm滤网过滤，2500转离心10分钟(300-1500g×5-10min)，细胞沉渣置于PBS中涂片，以甲醇固定，分别经HE染色和White Giemasa染色，计数200个非上皮细胞进行细胞分类，分类计算中性粒细胞、嗜酸细胞、淋巴细胞、单核细胞的百分比。
2.2外周血单个核细胞(PBMC)的分离和培养：
1)静脉采血2ml，EDTA抗凝，PBS等体积稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上，2500转离心20分钟；
2)吸取中间白膜层，以PBS充分洗涤后，以2000转离心10分钟，加入RPMI1640培养液调整PBMC密度为1×109/L；
3)将 PBMC1x109细胞/L培养于96孔培养板中，200ul/孔，加入anti—CD3(OKT3)(0.2mg/L)+antiCD28(1mg/L)进行共培养；
4)培养板置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，72h后收集上清存放至—80℃冰箱。
2.3外周血单个核细胞(PBMC)培养上清IL—5、IL-17的测定：通过酶联免疫法(Enzyme—Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)测定PBMC培养上清IL—5、IL-17水平，单位为pg/ml。
2.4血常规、血细胞形态、IgE水平的测定
1)血常规：静脉采血2ml到医院检验室完成。
2)血细胞形态：静脉采血1ml涂片后，经HE染色和White Giemasa染色，分类计算中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的百分比并观察各细胞的形态。
3)外周血免疫球蛋白E(IgE)测定：抽取外周血1～2ml后，离心分离出血清，
通过ELASA检测血清中IgE含量，IgE浓度单位是IU/ml。
2.5支气管壁厚度测量
1)取吸气末三个横断层面：主动脉弓上、气管分叉、下肺静脉，横断图像上每个层面选取双侧管腔内径0.5～2mm的气道各三支，由放射科医师测量管腔内径L、管腔外径D；
2)在计算机上通过程序计算气道壁的厚度T(T=(D-L)/2)、气道壁厚度与气道管腔外径之比值T/D、气道壁面积WA[WA=π(D/2)2-π(L/2)2]、气道壁面积占气道总截面积的百分比WA％=[π(D/2)2-π(L/2)2]/π(D/2)2x100％。
2.6肺功能测量
观察指标：用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼气量(FEV1)、第一秒用力呼气量/用力肺活量比值(FEV1/FVC)、75％呼气中期流量(MEF75％)、50％呼气中期流量(MEF50％)、25％呼气中期流量(MEF25％)、最大呼气峰流速(PEF)。
3.统计学方法
符合正态分布连续性计量资料用均数±标准差(-X±s)表示，两组均数比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用方差分析；双变量相关分析采取变量间pearson相关分析；P<0.05有统计学差异。所有数据统计分析均使用SPSS16.0软件包进行分析。
结论：
1.根据诱导痰炎症细胞的不同，可将儿童支气管哮喘分为嗜酸细胞型和非嗜酸细胞型。
2.IL—5参与哮喘发病，并与病情分度相关；IL—5水平与外周血、诱导痰嗜酸性粒细胞比例成正相关；IL—5在EA中的作用较NEA更为突出。
3.IL-17参与哮喘发病，并与病情分度相关；IL-17水平与外周血、诱导痰中性粒细胞比例成正相关；IL-17在NEA中的作用较EA更为突出。
4.IgE参与EA发病，与哮喘患儿外周血、诱导痰EOS比例成正相关。
5.支气管哮喘患儿气道壁厚度与气道管腔外径之比值T/D、气道壁面积占气道总截面积的百分比WA％与FEV1、MEF25％～75％成显著负相关，与IL-17水平成正相关。HRCT可作为无创手段监测哮喘患儿的支气管壁厚度，评估气道重塑情况。