【摘 要】
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目的:通过体外培养不同年龄兔角膜缘干细胞,观察其生物学特性随增龄的变化,探索适合兔角膜缘干细胞生长的最佳培养方法;并通过检测角膜缘干细胞标记物△Np63表达随增龄的变化
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目的:通过体外培养不同年龄兔角膜缘干细胞,观察其生物学特性随增龄的变化,探索适合兔角膜缘干细胞生长的最佳培养方法;并通过检测角膜缘干细胞标记物△Np63表达随增龄的变化,分析△Np63蛋白表达与角膜缘干细胞老化的相关性,探讨角膜缘干细胞衰老可能的分子机制,进一步揭示视觉功能衰退的成因,从分子生物学水平揭示眼表的生理特性及眼表疾病的成因,为临床诊疗及角膜缘干细胞移植供体的选择提供理论依据。方法:本实验选取3月龄,1.5年龄及3年龄新西兰白兔各6只,用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液对角膜缘干细胞的细胞悬液进行体外培养,取第二代细胞行△Np63免疫荧光染色,鉴定角膜缘干细胞。同期细胞分别应用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)和间接免疫荧光技术检测△Np63蛋白的表达量,最后应用SPSS13.0统计软件对所获数据进行统计分析。结果:角膜缘干细胞在低血清培养液中生长良好,增殖旺盛。随着增龄,角膜缘干细胞的形态发生改变,数量减少,体外培养增殖能力相应减弱。年龄越大,△Np63的表达量越低。间接免疫荧光法定量检测3月龄,1.5年龄及3年龄各组兔角膜缘干细胞△Np63相对含量平均值分别为121±22、94±23、46±16。SPSS13.0统计软件分析各组数据间差异有统计学意义(F=13.125,P＜0.05)。RT-PCR定量检测3月龄,1.5年龄及3年龄各组兔角膜缘干细胞△Np63相对含量平均值分别为0.7333±0.0117、0.6440±0.0143、0.3665±0.0106。SPSS13.0统计软件分析各组数据间差异有统计学意义(F=1451.222,P＜0.05)。结论:建立了兔角膜缘干细胞的体外培养方法;随着增龄,角膜缘干细胞呈现老化趋势;△Np63蛋白的表达具有明显的年龄相关性,随着增龄△Np63表达量下调可能是角膜缘干细胞老化的分子机制之一。
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