论文部分内容阅读
肿瘤是一类严重危害人类健康的常见病、多发病。虽然现在对肿瘤的防治方法种类繁多，但药物治疗更有其独特的优势。从天然产物中筛选天然、无害、易为人群接收且效果显著的抗肿瘤化合物(细胞毒素)，是目前肿瘤防治研究研究中关注的热点。黄嘌呤氧化酶(XO)是催化黄嘌呤氧化为尿酸的酶，然而尿酸生产过剩或分泌不足将导致痛风、心血管病等疾病发生，别嘌呤醇是临床上专用于治疗痛风的XO抑制剂，但是这个药物具有严重的副作用，如肝炎、肾病、过敏反应等。因此从天然产物中寻找活性高、副作用低的新型XO抑制剂是必要的。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物的各种组织间或器官内部的真菌、细菌或放线菌。越来越多的事实证明，植物内生菌已成为新结构和/或高活性化合物的重要资源，具有非常重要的研究意义和广阔的开发前景。本文从寻找新型细胞毒素和酶抑制剂出发，对在体外初试中，具有较强的抗菌活性两株植物内生真菌的次生代谢产物和具有抗黄嘌呤氧化酶活性的植物垂穗石松的化学成分和生物活性进行了研究。运用现代色谱技术技术，从此两株内生真菌和一株植物中共得到了44个化合物，运用现代光谱技术鉴定了其中33个化合物的结构，其中4个是首次发现的新化合物，同时还初步确定了未定结构的8个化合物的结构类型。并精心挑选了部分化合物分别测定了体外细胞毒活性、抗黄嘌呤氧化酶活性和抗菌活性，从中筛选出11个具有细胞毒活性、5个具有抗黄嘌呤氧化酶活性、2个具有抗菌作用和1个具抗幽门螺杆菌活性的化合物。其结果及创新点可小结为：
1．化学成分的研究。分离得到的化合物的结构类型非常丰富，共有14种类型，包括单端孢霉烯、单端孢霉烷、甾醇、酯、生物碱、脂肪酸、脑苷脂、皂甙、肽、黄酮甙、黄酮、二萜、三萜和苯酚酸。其中化合物myrothecine C(1)、myrothecine D(2)、chaetominine(20)和apigenin-4—O—(2”—O—p—coumaroyl)—β-D—glucopyranoside(29)为未见报导的新化合物，它们丰富了天然单端孢霉烷、单端孢霉烯、生物碱和黄酮甙类化学的内涵。并在研究中采用多种波谱技术，注意技术方法的借鉴和创新，摸索修订老方法，增加结构证明的可靠性。
2．生物活性研究。2.1细胞毒活性 体外细胞毒活性的研究实验表明，用来测试的15个化合物(1-5，13，20-21和29-34)均具有不同程度的细胞毒活性。其中，10种化合物对受试细胞表现出较强的活性：myrothecine C(1)和myrothecine A(5)对KB细胞生长的半数抑制浓度值(IC50)分别为57.5±0.25，15.6±0，．22μg/ml；化合物(29-31和34)对人肝癌细胞Bel7402生长的半数抑制浓度值(IC50)分别为9.8±0.24，13.09±0.28，8.12±0.21和13.04±0.29 μg/ml，对人肝癌细胞L02的IC50值为10.1±0.23，16.45±0.32，7.13±0.20，18.9±0.35μg/ml，对人肝癌细胞HepG2的IC50值为15.6±0.30，22.5±0.36，10.8±0.24，16.1±0.30 μg/ml：myrothecine D(2)、mytoxin B(3)、verrucarin A(4)和N，N—二甲基异咯嗪(13)表现出更强的细胞生长抑制活性，对KB细胞的半数抑制浓度值分别为IC50为0.066±0.0009、0.0042±0.00013、0.11±0．012、3.6±0.19 μg/ml，其活性优于或相当于阳性对照药物5—氟尿嘧啶(IC50为2.5 μg/ml)；化合物20具有很强的抑制人白血病细胞K562和结肠癌细胞SW1116的活性其IC50值分别是21.0±0.08和28.0±0.092 nM；阳性对照5—氟尿嘧啶对两株细胞IC50值分别为33.0和76.0 nM。因此，新化合物2，20这两种以前没有活性报道的天然产物，有希望成为具有潜在抗肿瘤活性的药物先导化合物。2.2抗黄嘌呤氧化酶活性体外抗黄嘌呤氧化酶的活性测试表明，化合物N，N—二甲基异咯嗪(13)、脑苷脂(21)、类黄酮—4—O—(2"—O—p—香豆酰基)—β-D—葡萄糖甙(29)、dillenetin(32)和rhamnazin(33)皆具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，其IC50值分别为60.32±0.48、55.5±1.8、23.95±0.43、7.24±0.16、7.24±0.16μM(其阳性对照临床用别嘌呤醇的IC50值为9.82±0．18μM)。通过分析得出，黄酮甙29-31对黄嘌呤氧化酶的抑制活性是依赖于其酰化的模式，即化合物29-31抑制酶活性明显的不同在于其6"—O—p—香豆酰基的存在影响了酶和抑制剂之间的结合反应。这可以为将来研究酰化的黄酮甙在抑制黄嘌呤氧化酶活性作用方面提供重要的参考资料，也为将来研究黄酮甙类化合物相关活性的构效关系提供思路。2.3抗菌活性体外抑菌活性表明，大多数测试化合物对大多数测试菌表现出中等抗菌活性，而两种内生真菌的乙酸乙酯粗提物相对于大多数化合物来说，表现出较宽的抗菌谱和较高的抑菌活性。化合物20对枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌和红发毛癣菌具有较强的抑制作用，其MIC分别为．5.24±0.48，6.33±0.51和6.86±0.53 μg/ml；化合物2对枯草芽孢杆菌具有极强的抑制作用，其MIC等于3.9±0.41μg/ml。其阳性对照的硫酸阿米卡星(细菌)和酮康唑(真菌)的MIC值均为3.9μg/ml。这预示着对于新的高效抗菌药物而言，此两种内生菌极具开发潜力。2.4抗幽门螺杆菌活性体外抑制幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)的活性测定，发现化合物25具有抗Hp的活性，MIC为10.0μg/ml，阳性对照氨苄青霉素(am]picillin)的MIC为2.0 μg/ml。它是具有开发潜力的植物内生菌次生代谢产物。
3．植物化学分类学意义我们从垂穗石松中分离得到了植物甾醇、黄酮类化合物、萜类化合物、苯酚酸、脂肪酸类化合物，但却没有发现存在于石松属植物的phlegmarane—，cernuane—和 quinolizidine—这几种类型的生物碱，希望这一发现可以作为分类上的证据，来解释垂穗石松被重新分类，单独列入垂穗石松属。
4．植物化学系统相关性的意义 酰化的黄酮甙虽然在许多种属的植物中被发现，但在糖基上连有一个或两个p—香豆酰基的黄酮甙类化合物目前只在石松科及其相关属、唇形科(Labiatae)和菊科(Asteraeeae)等很少的种属中发现。如同在非洲百合，鸭跖草和豌豆中所发现的：它的酰化模式与金属离子稳定的鳌合有关，则可以推断这类酰化的黄酮甙类化合物能在植物花的色素沉着生成上扮演着结构或化学上的角色。加上在本研究中发现的本类化合物(29)是一个新的黄嘌呤氧化酶抑制剂的事实，都表明来源于植物的酰化黄酮甙类化合物对于跨学科的研究非常有意义。
5．内共生和生物催化的意义 从内生菌M．roridum(IFB—E009)中发现了单端孢霉烷类大环内酯化合物这个事实，提示该类化合物的存在与微生物和宿主的内共生相关，同时还说明该菌是极具价值的产生环氧水解酶的新资源。