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背景与目的： 肺癌是世界常见的恶性肿瘤之一。近年来，许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率明显增加。据2008年世界卫生组织研究表明：全球男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性肺癌发病率占第四位，死亡率占第二位。虽然目前肺癌诊断和治疗已取得了很大的进步，但其5年生存率仍然很低。多年来的研究表明，肺癌发病是一个多基因参与、多步骤的复杂病变过程，先是产生组织学上可以辨认的癌前病变，最后导致侵袭性肿瘤产生。细胞遗传学和分子生物学研究表明，多个癌基因、抑癌基因在肺癌的发生发展过程起决定性作用，如ras家族、myc家族、EGFR、c-erbB-2、Bcl-2、c-fos等癌基因，他们的突变或扩增会促进细胞恶性增殖，导致肺癌发生，而p16、RB、p53等抑癌基因，其表达可抑制细胞增殖，但在肺癌中，他们通常因突变而失活或因基因丢失而失去表达，同样促进了肺癌的发生。 人类基因组计划完成了人类基因组近30亿个核苷酸碱基的序列测定，确定了约3万个蛋白编码基因，发现蛋白编码基因只占基因组的约2％。大规模转录组分析发现，人类基因组大多区域具有转录活性，除蛋白编码基因外，剩下的区域也可发生转录，其转录产物大多为非编码RNA。这些非编码RNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。近年来，越来越多的研究表明，非编码RNA转录本在细胞和生物体的各个调控途径中发挥着重要作用，不断有研究发现具有重要生物学功能的非编码RNA。这些非编码RNA可分为miRNA、piRNA、snoRNA和长链非编码RNA（longnoncodingRNA,lncRNA）等。 长链非编码RNA，是一类长度超过200个核苷酸，但不具有蛋白编码能力的RNA。它们是非编码RNA中最大的一类。随着一些lncRNA的重要功能的阐释，对lncRNA的研究也得到了人们的重视。近几年大量的研究表明lncRNA具有广泛的生物学作用，它可在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种水平上调节基因的表达。研究还发现部分lncRNA与癌症的发生发展密切相关。一些lncRNA的表达具有肿瘤特异性，可作为肿瘤诊断和治疗新的分子标志物，如lncRNAPCA3在前列腺癌中高度过表达，可作为前列腺癌高度特异的核酸分子标志物，其特异性高于血清前列腺癌特异性抗原(PSA)，现在已经被开发成临床的商业化试剂盒；还有一些lncRNA在肿瘤发生发展过程中发挥着举足轻重的作用，被认为癌基因或抑癌基因，如H19、HOTAIR、PCGEM1等。也有不少肺癌相关的lncRNA与的报道，如MALAT1、MEG3、SCAL1等也与肺癌相关。目前lncRNA相关研究较多，但大部分的lncRNA功能仍然未知，其作用机制的相关研究则更为稀少，仅少数lncRNA的机制得到了一定程度的阐释，因此寻找具有重要功能的lncRNA并探索它们的作用机制非常重要，尤其是寻找与肿瘤相关的lncRNA，可极大地促进人们对肿瘤发生发展的认识。在本课题研究中，我们寻找与肺癌相关的lncRNA，并进一步探索它们的功能和可能的作用机制。 之前我们实验室的一些研究结果表明，lncRNALOC728228在肺癌16HBE-T和A549细胞中高表达，下调LOC728228的表达会导致细胞增殖抑制，且细胞出现周期G0/G1期阻滞，但细胞凋亡并不受影响。稳定下调LOC728228的表达会导致肿瘤细胞克隆形成能力减弱，细胞侵袭转移能力减弱，且在裸鼠成瘤实验中，LOC728228表达下调的肿瘤细胞形成的肿瘤体积较小，生长较慢等，说明LOC728228在肺癌细胞中具有类似于癌基因的功能。 本文针对LOC728228的以上功能，探索它可能的作用机制。结果表明LOC728228不具有顺式作用功能，且其RNA主要分布于细胞浆，说明它可能在细胞浆中发挥作用。由于它的下调导致细胞周期阻滞，因此检测了周期相关基因的表达，发现LOC728228下调后，cyclinD1下调明显，而下调cyclinD1确实可导致细胞增殖抑制和细胞周期G0/G1期阻滞。说明LOC728228可能是通过调节cyclinD1来发挥作用的，但其具体的调节机制还不清楚。 方法： 1.定量RT-PCR检测基因表达siLOC728228-2转染16HBE-T细胞，用SYBRGreen染料法对LOC728228邻近基因进行qRT-PCR定量检测。 2.LOC728228胞浆胞核分布按AmbionPariskit试剂盒说明书进行操作，分别提取16HBE-T细胞核和细胞浆RNA，并用qRT-PCR检测LOC728228在胞浆、胞核中的相对表达。 3.siRNA瞬时转染用Lipofectamine-2000将siRNA按说明书的转染步骤导入16HBE-T细胞，用qRT-PCR定量检测siRNA敲除效果，并确定其有效序列和最佳转染浓度。 4.细胞增殖实验96孔板每孔接种3×103个细胞，24小时后转染siRNA，分别于转染24h、48h和72h后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。 5.细胞周期实验6孔板种板，每孔10万个细胞，24小时后转染siRNA，转染48h后收集细胞，70%酒精固定过夜，PI染色，用流式细胞仪检测细胞周期。 6.统计分析采用SPSS13.0进行统计分析。所有试验数据均至少3次重复，数据以x?s表示。两组间比较双侧t检验，3组以上的比较采用单因素方差分析，所有检验均以双侧P﹤0.05为差异有统计学意义。 结果： 1.下调LOC728228后，其邻近基因的表达变化用siLOC728228-2干扰序列转染16HBE-T细胞，处理48小时后，qRT-PCR检测发现，LOC728228的表达下调明显，其大部分邻近基因的表达与对照组相比不具有统计学差异，部分基因表达出现改变，与对照组相比具有统计学差异（p<0.05），但差异均小于2倍。 2.LOC728228基因的胞浆胞核分布qRT-PCR检测目的基因和多个内参基因，结果表明，内参基因的胞浆胞核比均与实际情况相符，目的基因LOC728228第一对引物检测的胞浆胞核比为3.00±0.81，第二对引物检测的比值为3.13±0.94。 3.用siRNA敲除目的基因后的表达变化分别用3个siCCND1序列转染处理16HBE-T细胞48h后，qRT-PCR检测cyclinD1的表达，结果表明siCCND1-1和siCCND1-3在16HBE-T细胞中抑制cyclinD1的效果较好，与16HBE-T和NC组相比差别有统计学意义（P<0.01）。siCCND1-1的最佳使用浓度为30nmol/l，siCCND1-3的最佳使用浓度为50nmol/l，两者干扰效率都达到85%以上，与16HBE-T和NC相比差别有统计学意义（P<0.01）。 4.转染后细胞增殖能力改变用siCCND1-1和siCCND1-3分别转染16HBE-T细胞，48h、72h细胞活力出现明显下降，与空白对照组和NC相相比差别具有统计学意义（P<0.05）。48h细胞活力分别为（0.29±0.02）和（0.28±0.03），72h细胞活力分别为（0.43±0.05）和（0.39±0.01）。 5.转染后细胞周期改变分别用siCCND1-1和siCCND1-3转染处理16HBE-T细胞48h后，与空白对照组和NC组相比，转染siCCND1组细胞出现G0/G1期阻滞。细胞G0/G1期分别由69.64%上升至79.35%、82.61%，而S期分别由27.22%下降至16.96%、14.88%，与空白对照组和NC组相比差别具有统计学意义（P<0.05）。 结论： 1．lncRNALOC728228不具有顺式作用功能。 2．lncRNALOC728228的转录产物主要分布于胞浆中。 3．下调LOC728228后，cyclinD1mRNA也出现下调。 4．下调cyclinD1导致细胞增殖抑制和细胞周期G0/G1期阻滞，LOC728228可能是通过调节cyclinD1的表达发挥作用。