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冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉成形术和药物治疗使许多由于冠脉粥样硬化而引发心肌缺血患者的临床症状和预后明显改善。然而对于严重而弥漫的血管病变、血管手术后的阻塞、手术后的血管病变目前尚无其他的有效治疗措施。运用基因转移方法将具有促血管生成作用的生长因子导入心肌可以有效地促进新生血管的发生和生长，改善心肌的供血，为冠心病的治疗开辟了一条新的途径。 肝细胞生长因子(HGF)是一种特异性的血管内皮生长因子，具有促进多种细胞的有丝分裂、细胞运动、组织发育及促进血管新生等多种生物学作用。复制缺陷型腺病毒载体是有效的载体之一，已用于转染各种组织和细胞，为探讨腺病毒介导的人类HGF基因对缺血心肌血管新生的作用，我们构建了含人类HGF基因的复制缺陷的重组腺病毒载体(Ad-HGF)，体外研究腺病毒载体的转染率和表达效率，在证实了Ad-HGF培养上清对内皮细胞有促增殖作用的基础上，我们通过两种途径将重组腺病毒载体导入大鼠缺血的心肌组织，探讨合适的基因转导途径，以及两种不同途径外源性基因的表达范围和表达持续时间，Ad-HGF是否可以促进血管的生成，以评价在体内应用的效果。在得出阳性结果后，我们采用直接心肌注射的方法将外源性基因导入犬急性缺血的心肌，观察腺病毒载体对犬急性心肌缺血模型在形态、功能和药效学方面的效果，为人体临床实验奠定基础。 本课题的主要方法： 1．复制缺陷型重组腺病毒Ad-HGF的构建 一 采用分子克隆手段获得携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组质粒， 和携带人肝细胞生长因子（HGF）的重组质粒pXCHGF，以细胞内同源 重组法构建重组腺病毒Ad－GFP、Ad－HGF。在293细胞内分别扩增应 用氯化艳密度梯度离心法纯化病毒，斑蚀分析法测定病毒感染滴度。 2 AdHGF r＃漱JC。M瓣…ff椭…淑 分离培养胚胎鼠心肌细胞，荧光显微镜观察心肌细胞转染后1、2、3。 5、7、14、21、28天绿色荧光蛋白的表达情况，应用酶联免疫吸附分析 （ELISA）方法和免疫组化方法检测转染后细胞培养上清 HGF的表达。 MTT法测定 Ad－HGF转染后 7、14大的培养上清对内皮细胞系 ECV304 的增殖作用。 3 AdHGF禽舆大厨怠牲心珊舢一…酿 体重250刁 的Wistar大鼠90只，全麻下开胸，结扎左冠状动脉主 干，建立大鼠急性心肌缺血模型。动物随机分为5组：组I：Ad－HGF 心肌内用药组；组H一心室腔注射AdHGF组；组111卜心肌内注射Ad－GFP 组；组IV：心室腔注射Ad－GFP组；组V：空白对照组，即心肌内注射 生理盐水组。动物模型建立成功后，在冠状动脉左前降支供血区域的左 心室变色区作心肌单点注射，注射量为 100 ul，病毒量为 10下fu，每组 分别于3、7、14、ZI天各处死3只，取心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾 脏、脑组织、眼球和睾丸作冰冻切片观察＊P的表达情况：同时取血检 测HGF的表达情况；组织病理学观察心肌的缺血、炎症程度，200倍视 野下进行血管计数。 4 AdHGF庄犬龄血牲心咽臼奉动匆模型中勿应屏 健康杂种犬30只，体重20－25kg，全麻下左第五肋间切口，于左前降 支第一对角支以下结扎冠状动脉。模型建立成功后，动物随机分为5组： I组：AdGFP组（ 8 X 10＊pm／body ），11组：大剂量 AdHGF组（8 X 10＊ 3 一 pm／body），！IIfll：。1－。等剂 Ad－HGF fit（IXI（）’pfu／body），IVfll：。J。）＼IJ IX Ad－HGF全（ZXI＊‘pfu／body），V乏：士l”I对JZ附n（心J＊内注O叫｛Jql 盐水扔）。， 分别／h人心V变色区的边缘、／hi订阶训ti（I卜．队O）讥 8。IJ、1：加＋；，1“Z；‘i 扎冠状动脉前，手术）干 7人、14人、ZI人用128人分别）1h圳泳、人｛心）力 取血，微球法测昆心肌局部血流量：在手术后1、3、7、14、引、二8无 抽血进行血常规、肝功酶和心肌酶的检测以探讨使用安全性的问题；实 验终点每组随机取2只进行冠状动脉造影检查侧枝血管的存在和分布； 心肌TTC染色作病理图像分析，以确定心肌梗死面积。 主要结果： 1．我们使用的细胞内同源重组腺病毒的构建方法稳定、有效，在293 细胞内扩增后的 AdHGF、Ad－（iFP 经氯化艳纯化滴度分别为 8刀 X 1010pm／ml气 11X 1011 pm／mlo 2．AdGFP 体外转染培养的心肌细胞显示，随着病毒感染复数 （multiplicity of infection MOI）的增大，腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染 率相应提高，当 MOI大于 50pfu／细胞时，转染率几乎达到 100％，AdGFP 转染体外培养心肌细胞后GFP的表达在第一天即可看到，随着时间的推 移，阳性细胞比例逐渐增加，7天后达到高峰，此后，GFP的表达呈现 下