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胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESC)是一种包含个体全部遗传信息且能够自我更新的发育全能性细胞,可以从内细胞团或原始生殖细胞分离获得。近几年关于鸡胚胎干细胞建系的研究越来越多,其培养的难点就是在使鸡胚胎干细胞无限增殖的同时维持其未分化状态。端粒是真核细胞染色体的末端物质,细胞每分裂一次,端粒便随之缩短50-100bp,当其缩短到某一特定值时,细胞将失去增殖力,进入老化、凋亡状态。hTERT基因对端粒酶激活具有促进作用,将外源的hTERT基因导入细胞,能够使细胞增殖时端粒缩短的速度减慢或停止。本研究成功构建真核表达载体pEGFP-hTERT,并转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells, cESCs),使得细胞内部hTERT基因高表达,再通过改善外部培养条件,从而使鸡胚胎干细胞在体外能够进行长期稳定的传代培养,为后续鸡胚胎干细胞的建系提供了理论依据和实践基础。主要研究内容如下：1.pEGFP-hTERT真核表达载体的构建及其亚细胞定位研究。提取质粒PCI-neo-hTERT,用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后回收到的3.5kb片段即为目的基因hTERT,然后利用T4连接酶与荧光真核表达载体pEGFP-N1连接构建重组质粒pEGFP-hTERT。采用LipofectaminTM转染法进行转染DF-1细胞,以5×105个/mL接种到24孔板内,转染24h后于荧光倒置显微镜下观察。试验组：转染重组质粒pEGFP-hTERT;阴性对照组：转染空载体质粒pEGFP-N1;空白对照组：未转染质粒。结果显示试验组与阴性对照组均有绿色荧光表达,表明pEGFP-hTERT重组质粒成功转入细胞,空白组未见绿色荧光。2. VC(Vitamin C, VC)对鸡胚胎干细胞增殖的促进作用。将鸡胚胎干细胞按1×103个／孔的密度接种到96孔板,然后分别将VC以0μmol/L、10μmol/L、100μmol/L以及1000μmol/L的浓度加入到细胞培养孔中,最后加入CCK-8后用酶标仪测定每孔细胞的OD值来检测细胞的增殖,OD值与细胞的数目成正比,结果表明添加10μmol/LVC的细胞OD值最大,即细胞数目最多,为促进鸡胚胎干细胞分裂增殖的最适浓度。3. pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞及传代培养。采用镊子夹取法直接夹取胚盘后分离培养cESCs,以80%大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)与20%的胚胎干细胞基础培养液混合的条件培养基培养分离的cESCs,添加适宜浓度的L-抗坏血酸促进其增值。培养的细胞AKP染色呈红棕色,相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定呈阳性,这表明细胞仍处于未分化状态,可以用于后续试验。用FuGENE(?) HD转染法进行转染cESCs,然后以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cESCs,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明：pEGFP-hTERT转染的cESCs可持续传至15代以上,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异性不显著。