【摘 要】
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目的:胰腺癌被称为“癌中之王”,随着医疗技术手段的不断革新,多种类型恶性肿瘤死亡率逐年降低,然而,胰腺癌的五年生存率依然徘徊在5%左右。因缺乏早期特异性症状,胰腺癌的发病过程极为隐匿,且拥有极强的侵袭性,大部分患者在首次诊断时就已为晚期,错失手术机会。同时,胰腺癌对放疗以及化学治疗均不敏感,治疗手段极度匮乏。目前关于胰腺癌的发病原因,发展机制依旧不甚明了,深入探索胰腺癌发生发展中积累的表观遗传学事
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目的:胰腺癌被称为“癌中之王”,随着医疗技术手段的不断革新,多种类型恶性肿瘤死亡率逐年降低,然而,胰腺癌的五年生存率依然徘徊在5%左右。因缺乏早期特异性症状,胰腺癌的发病过程极为隐匿,且拥有极强的侵袭性,大部分患者在首次诊断时就已为晚期,错失手术机会。同时,胰腺癌对放疗以及化学治疗均不敏感,治疗手段极度匮乏。目前关于胰腺癌的发病原因,发展机制依旧不甚明了,深入探索胰腺癌发生发展中积累的表观遗传学事件,探索全新胰腺癌分子标记物以及治疗靶点具有重要的临床意义以及社会价值。CLK1（Cdc2-like kinases1）是介导可变剪接的重要功能分子,已被报道与多种恶性肿瘤密切相关,然而,在胰腺癌中,CLK1的表达情况以及作用机制国内外鲜有报道。本研究首次明确了CLK1在胰腺癌中高表达且与胰腺癌患者预后密切相关,通过体内外的分子生物学实验明确CLK1与胰腺癌的细胞周期紊乱及增殖密切相关,同时对CLK1下游可能调控的剪接因子进行了筛选并验证其功能,并完整的观测了CLK1下游介导的可变剪接事件。本研究旨在阐明CLK1在胰腺癌细胞周期紊乱的作用及其机制,对CLK1在胰腺癌中的具体作用机制进行完整探索讨论,力图对胰腺癌早期诊断以及靶向治疗提供新的科学基础以及理论依据。方法:1、采用TCGA、GEO两个公共数据库、免疫组化（IHC）及免疫印迹法（Western Blotting）对胰腺癌患者CLK1的mRNA以及蛋白的表达量进行检测,同时结合胰腺癌患者的临床病理资料,对CLK1在胰腺癌中的表达情况以及与胰腺癌患者临床病理特征及预后的相关性进行分析;2、利用慢病毒包装技术在胰腺癌细胞系中稳定过表达或者干扰CLK1表达,并通过Western Blotting验证转染效果;3、通过CCK8试验、细胞计数法、平板集落形成试验对CLK1在胰腺癌细胞增殖中的影响进行检测;4、利用流式细胞技术（PI染色法）对CLK1在胰腺癌细胞周期的影响进行评估,利用Western Blotting对CLK1干扰或过表达后的细胞周期调控相关蛋白p21、p53的表达水平进行检测;5、通过裸鼠皮下成瘤实验在体内对CLK1在胰腺癌细胞增殖中的影响进行验证;6、利用非标记定量磷酸化蛋白质组学技术筛选CLK1下游可能影响的剪接因子,并通过Western Blotting对筛选结果验证,利用慢病毒包装不同磷酸化状态质粒对剪接因子功能进行验证;7、利用高通量测序技术对CLK1及下游剪接因子调控的可变剪接事件进行完整观测,利用PCR验证下游基因可变剪接模式改变;8、构建差异可变剪接基因不同异构体的质粒,利用分子生物学技术对差异可变剪接基因进行功能学验证。结果:1.在胰腺癌组织标本中,CLK1的mRNA和蛋白表达均增高;2.CLK1在胰腺癌中高表达且与胰腺癌患者临床病理特征以及生存预后密切相关;3.过表达CLK1促进胰腺癌细胞增殖,干扰CLK1表达抑制胰腺癌细胞增殖;4.CLK1介导胰腺癌细胞周期紊乱,并调控细胞周期p21、p53的表达;5.SRSF5Ser-250（250位丝氨酸）被CLK1磷酸化并参与调控胰腺癌增殖;6.CLK1-SRSF5轴主要参与胰腺癌细胞周期相关性可变剪接事件的调控;7.CLK1-SRSF5轴主要参与胰腺癌可变剪接类型为外显子跳跃;8.CLK1-SRSF5轴介导Cyclin L2exon6.3跳跃,Cyclin L2可变剪接模式改变参与胰腺癌恶性行为的调控,Cyclin L2长链促进胰腺癌细胞增殖,Cyclin L2短链抑制胰腺癌细胞增殖。结论:1.CLK1与胰腺癌密切相关,有望开发为胰腺癌诊断以及治疗的新靶点;2.CLK1介导胰腺癌细胞周期紊乱,并在体内外促进胰腺癌细胞增殖;3.CLK1磷酸化SRSF5250ser,并参与胰腺癌细胞恶性行为调控;4.CLK1-SRSF5轴主要介导胰腺癌细胞周期相关性可变剪接改变;5.CLK1-SRSF5轴介导Cyclin L2exon6.3跳跃,参与胰腺癌恶性行为调控,在临床上可以作为治疗胰腺癌的潜在靶点。
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