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补体系统是人体重要的免疫防御系统,它的过度激活会导致各种组织的损伤。目前临床用的抗补体药物缺乏专一性,并有一定的毒、副作用。而近年来的研究表明中药活性多糖在这方面具有独特的优势和潜力。为了发现和优化多糖类补体抑制剂,本课题采用活性导向分离的方法,以连翘为原料,经水提、醇沉、DEAE-cellulose阴离子交换色谱、QSepharoseFastFlow强阴离子交换色谱和葡聚糖凝胶色谱法分离纯化,得到四个均一多糖,分别为Fs-7-q3-b,Fs-8-ba2,Fs-8-bb1和Fs-8-d。
采用HPGPC、IR、绝对构型测定、糖组成分析、甲基化分析、糖醛酸还原、部分酸水解等方法对这四个均一多糖进行结构鉴定。结果表明:Fs-7-q3-b是一分子量为5.6×103Da的鼠李葡萄聚糖,主要是由1,6-1inked葡萄糖组成,鼠李糖以端基的形式存在;Fs-8-ba2是一个分子量为7.2×103Da,主链为含有7个HG片段及2个RGⅠ片段的果胶,支链主要位于1,2,4-linkedα-L-rhamnose的O-4位上;Fs-8-bb1是一个分子量为5.3×103Da的杂多糖,主要含有葡萄糖、鼠李糖和半乳糖以及少量阿拉伯糖、甘露糖和岩藻糖,主要由1,4-1inkedGlc组成的含有少量支链的多糖;Fs-8-d是一个分子量为1.14×104Da,并含有糖醛酸的酸性杂多糖,主要由1,4-1inkedGlc及1,6-1inkedGal组成,支链主要位于Glc上。
运用红细胞溶血法,以肝素钠作为阳性对照,对这四个均一多糖进行经典途径及旁路途径的抗补体活性的评价。结果表明:这四个均一多糖均有一定的抗补体活性。Fs-7-q3-b,Fs-8-ba2,Fs-8-bb1,Fs-8-d及肝素钠的抗补体经典途径IC50分别为:0.514±0.015,0.311±0.020,0.683±0.007,0.3875±0.007及0.045±0.002mg/ml;旁路途径IC50分别为:0.595±0.133,0.218±0.015,1.322±0.094,0.377±0.026,0.165±0.034mg/ml。同时检测了抗补体活性相对较强的Fs-8-ba2的抗补体作用靶点,结果表明Fs-8-ba2的作用靶点位于Clq、C1r、C1s、C2、C3和C9上。对这四个多糖进行了体外凝血时间、凝血酶原时间的测定,来评价这四个均一多糖对凝血系统的影响。结果表明,四者均没有显著性延长凝血时间及凝血酶原时间,初步结果显示,四者没有抗凝血作用,可作为良好的补体抑制剂。
通过以上研究,确定了这四种均一多糖的一级结构,并评价了均一多糖的抗补体活性。这四个多糖在体外抗补体实验中表现出一定的抗补体作用,且并无抗凝血活性,可作为补体抑制剂的备选药物。本课题为连翘多糖防治补体介导的疾病提供参考依据。