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研究背景：胃癌是严重危害人类健康和生命的最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内均具有较高的发病率和致死率。且就诊病人绝大多数属于进展期胃癌，预后较差，五年生存率徘徊在20％～30％。为早期发现胃癌、提高胃癌的治疗效果、延长患者生存期，必须深入研究胃癌的起源、发生发展机制及其分子生物学行为，以期发现新的治疗靶点，从基因或分子生物学水平阻断胃癌发生或进展。近年的研究显示，包括胃癌在内的实体肿瘤的生长和转移必须依赖新生血管的生成。肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的基础，当实体肿瘤直径大于1～2mm后，它的生长就必须依靠新生血管。如果肿瘤不能血管化，生长至2～3mm便发生退化。因此新生血管形成是肿瘤发生发展中的关键环节之一。新生血管不仅为肿瘤生长提供营养物质和氧以及排出代谢废物，并为肿瘤细胞进入血液循环和转移提供可能，因此血管生成在由癌前病变渐变为癌以及肿瘤形成后的发展、转移过程中发挥着极为重要的作用，是肿瘤得以迅速生长和发展的关键。肿瘤血管生成是一个多基因、多因子参与的过程，在这一过程中肿瘤细胞不仅能分泌许多种促进血管形成、加速肿瘤发展的因子，同时也能分泌许多抑制血管形成、促使肿瘤退化、凋亡、防止转移的因子，该过程受到“血管生成开关”系统精密调控，使血管生成刺激因子和抑制因子保持平衡。肿瘤生长还是消减取决于促进血管生长因子和抑制血管生长因子含量的对比变化。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和Endostatin分别是目前已知的作用最强的血管生成促进因子和抑制因子，VEGF可促进内皮细胞增殖及血管新生，提高血管通透性，改变细胞外基质的成份和结构，在组织器官的发生、正常状态的维持以及多种肿瘤的发生、发展中都发挥着重要的作用。Endostatin可特异性地抑制内皮细胞增殖、迁移和肿瘤血管生成，诱导细胞凋亡，使肿瘤原发、转移灶处于休眠状态，停止生长。Endostatin又可竞争性地阻断VEGF诱导血管生成的信号传导通路、减少血管内皮细胞膜VEGF受体的数量、降低体内VEGF mRNA水平表达；阻断bFGF信号传递，抑制bFGF诱导的血管内皮细胞增殖、迁移。体外和动物实验表明Endostatin及其类似物在体外能有效抑制内皮细胞的生长、移行，在体内显著退缩和停滞原发瘤和转移瘤的生长。有研究显示肝癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中存在着VEGF和Endostatin的高表达，但VEGF和Endostatin在胃癌中表达的研究却报道甚少，且已有的报道仅限于VEGF或Endostatin单个因子血清浓度或mRNA表达水平的研究，联合检测VEGF、Endostatin在胃癌中表达含量的对比变化及其相关关系的研究尚未见报道。深入研究VEGF和Endostatin在胃癌生长、浸润、转移中的作用及其相关关系和手术前后表达水平的变化规律对深刻认识血管新生在胃癌发生发展中的作用、胃癌早期诊断、判断预后和抗血管治疗等方面具有重要的基础和临床意义。目的：本研究拟通过ELISA法检测胃癌患者、慢性胃炎患者和健康人群中血清VEGF和Endostatin的水平，并分析血清VEGF和Endostatin的水平与胃癌临床病理学指标的关系，以期探讨：①胃癌患者、慢性胃炎患者及健康人群中血清VEGF、Endostatin的水平；②VEGF、Endostatin水平相关关系及其与胃癌临床病理生理特征的关系；③胃癌患者手术前后血清VEGF、Endostatin水平的动态变化。通过对上述问题的探讨，初步了解促血管生成因子和血管生成抑制因子在胃癌侵袭、转移中的相互作用。应用RT-PCR法检测胃癌组织和癌旁正常胃组织中VEGF和Endostatin mRNA的转录表达，应用免疫组化和Western blotting技术检测胃癌组织和癌旁正常胃组织中VEGF和Endostatin的蛋白表达水平，并以免疫组化方法测定胃癌组织和癌旁正常胃组织中微血管密度，以期探讨：①胃癌组织和癌旁正常胃组织中VEGF、Endostatin mRNA和蛋白的表达水平；②VEGF、Endostatin mRNA和蛋白表达水平与胃癌临床病理生理特征的关系；③VEGF、Endostatin、MVD之间的相关性。通过对上述问题的探讨，进一步论证VEGF、Endostatin在胃癌侵袭、转移中的作用，并深入揭示肿瘤血管形成机制及其影响因素，为开发、研制肿瘤血管新生抑制剂，从分子生物学水平治疗胃癌提供新的思路和治疗靶点。材料与方法：第一部分：1．病例选择：山东大学齐鲁医院2004年10月至2005年10月普外科收治的初诊胃癌患者60例，诊断均经术后病理证实。并选择同期消化内科住院的慢性胃炎患者30例及健康人群30例作对照。2．标本留取与检测：所有患者均于入院未治疗前清晨空腹(健康人群则随机清晨空腹)抽取外周静脉血、分离并留取血清置-70℃低温冷冻备用。手术治疗的痛症患者于手术后2周同法收集血清冷冻备用。ELISA法检测血清VEGF和Endostatin水平。3．统计学处理：所有数据以(均数±标准差)表示，各组间均数比较用t检验或方差分析，相关关系应用Pearson相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。第二部分：1．病例选择：山东大学齐鲁医院及潍坊医学院第三附属医院普外科2005年6月至2006年8月接受手术治疗的初诊胃癌患者36例，其中男性23例，女13例：年龄37岁～75岁，所有患者均经术后病理证实。2．标本留取：手术室内取患者手术切除的新鲜癌灶标本和距癌灶至少5cm以外的胃组织各2块并分为两份，取得标本后一份立即放入液氮中速冻并保存，准备做逆转录聚合酶链反应和Western blotting用，另一份用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，用作HE染色、免疫组化。3．实验方法：①RT-PCR检测胃癌组织及癌旁正常胃组织VEGF、Endostatin mRNA表达：实验所用物品去RNase处理，组织低温下研碎，提取总RNA，进行逆转录(RT)反应合成cDNA、聚合酶链反应(PCR)扩增产物。定量分析：将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统，应用1D Image Analysis Software进行表达强度分析，按下公式计算相对系数：相对系数=目的基因表达强度／β-actin表达强度。②免疫组化法检测胃癌组织及癌旁正常胃组织VEGF、Endostatin蛋白表达及微血管密度测定：制备切片并分别做VEGF、内皮抑素及CD34免疫组化，另行常规HE染色。结果判定以染色呈棕黄色颗粒为阳性表达。VEGF及Endostatin染色结果根据阳性细胞显色深浅及阳性细胞百分率分级分别进行评分，根据相加得分判定表达强弱。CD34染色阳性的单个内皮细胞或一簇内皮细胞作为一个微血管，在200×视野下计数3个血管密度最高区域(热点)的微血管数目，取其平均值即为肿瘤的微血管密度(MVD)。结果判断在双盲下进行，每张切片由两位资深病理医师分别阅片记数。③Western blotting检测胃癌组织及癌旁正常胃组织VEGF、Endostatin蛋白表达：取新鲜组织块，称量后提取蛋白、加上养液、煮沸、上样电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、终止反应。扫描图像，输入美国Kodak图像分析系统，应用1D Image Analysis Software进行表达强度分析，按下公式计算相对系数：相对系数=目的蛋白表达强度／β-actin表达强度。4．统计学处理：计数资料数据以(均数±标准差)表示，计量资料数据以率或百分比表示。SPSS13.0统计软件进行统计学分析。采用的统计学方法包括t检验、x~2检验及Pearson相关性分析等，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果：第一部分：1．胃癌患者手术前血清VEGF水平(394.81 pg／ml+159.49 pg／ml)显著高于慢性胃炎患者(125.90 pg／ml+18.09 pg／ml)及健康人群组(117.54 pg／ml±25.27pg／ml)，P均＜0.01。2．胃癌患者手术前血清Endostatin水平(56.05 ng／ml±13.86 ng／ml)显著高于慢性胃炎患者(34.01 ng／ml±4.39 ng／ml)，及健康人群组(32.82 ng／ml±6.71ng／ml)，P均＜0.01。3．胃癌患者手术前血清VEGF水平与Endostatin水平呈显著正相关(r=0.583，P＜0.01)。4．胃癌患者手术前血清VEGF、Endostatin水平与细胞分化程度、肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、远处转移及P-TNM分期密切相关(P均＜0.05)，与性别因素无关(P均＞0.05)。5．胃癌患者手术后2周血清VEGF水平(203.28 pg／ml±97.31 pg／ml)较手术前显著下降(P＜0.01)，而手术后2周血清Endostatin水平(65.96 ng／ml±14.33ng／ml)则较手术前升高(P＜0.01)，差异均有统计学意义。第二部分：1．胃癌组织VEGF mRNA表达水平显著高于癌旁正常胃组织[(0.7790±0.1871)vs(0.3436±0.1581)]，胃癌组织Endostatin mRNA表达水平亦明显高于癌旁正常胃组织[(0.6735±0.1603)vs(0.5424±0.1625)]，差异均具有统计学意义(P均＜0.01)。2．胃癌组织VEGF、Endostatin mRNA表达均与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、远处转移和P-TNM分期密切相关(P均＜0.05)，而与年龄、细胞分化程度无关(P均＞0.05)。3．胃癌组织VEGF mRNA和Endostatin mRNA表达水平之间呈显著正相关(r=0.613，P＜0.01)。4．免疫组化法检测胃癌组织VEGF蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常胃组织(80.56％vs22.22％，x~2=24.519，P＜0.01)，胃癌组织Endostatin蛋白阳性表达率亦显著高于癌旁正常胃组织(61.11％vs25.00％，x~2=9.574，P＜0.01)，差异均具有统计学意义。5．免疫组化法检测胃癌组织VEGF蛋白表达水平与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移和P-TNM分期密切相关(P均＜0.05)，Endostatin蛋白表达水平与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、远处转移和P-TNM分期密切相关(P均＜0.05)。VEGF、Endostatin蛋白表达水平与年龄、细胞分化程度无关(P均＞0.05)。6．免疫组化法检测胃癌组织MVD明显高于癌旁正常胃组织[(43.67±8.59)vs(12.14±6.08)](P＜0.01)，差异有统计学意义。胃癌组织MVD与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、远处转移和P-TNM分期密切相关(P均＜0.05)，与年龄、细胞分化程度无关(P均＞0.05)。7．Western Blotting检测胃癌组织VEGF蛋白表达水平明显高于癌旁正常胃组织[(0.6065±0.1805)vs(0.3380±0.1527)](P＜0.01)，胃癌组织Endostatin蛋白表达水平亦明显高于正常胃粘膜组织[(0.6000±0.1524)vs(0.3481±0.1480)](P＜0.01)，差异均具有统计学意义。8．Western Blotting检测胃癌组织VEGF蛋白表达水平与Endostatin蛋白表达水平亦呈显著正相关(r=0.581，P＜0.01)。9．Western Blotting检测胃癌组织VEGF和Endostatin蛋白表达水平均与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、远处转移和P-TNM分期密切相关(P均＜0.05)，与年龄、细胞分化程度无关(P均＞0.05)。10．Pearson相关性分析表明，胃癌组织中VEGF mRNA表达水平及蛋白表达水平(Western blotting)与MVD之间均呈显著正相关(相关系数r分别为0.509、0.535，P均＜0.01)，而Endostatin mRNA及蛋白表达与MVD之间均无明显相关关系(相关系数，r分别为0.229、0.295，P均＞0.05)。结论：1．胃癌组织内存在着VEGF和Endostatin的高表达，血清VEGF和Endostatin水平亦显著升高。2．高表达水平的VEGF和Endostatin与胃癌浸润深度、区域淋巴结转移、远处转移及P-TNM分期等肿瘤恶性生物学行为密切相关，是评价胃癌恶性行为、预测浸润和转移程度的有效指标。3．胃癌组织中MVD显著升高，且与胃癌浸润深度、区域淋巴结转移、远处转移及P-TNM分期密切相关，亦可反映胃癌的恶性侵袭能力及转移程度。4．高表达水平的VEGF和Endostatin之间呈正相关关系，对胃癌新生血管的生成具有重要的调节作用并相互拮抗，共同影响着胃癌的血管新生和浸润转移。5．VEGF、Endostatin可望成为胃癌抗血管治疗的重要靶点。