论文部分内容阅读
背景与目的肺癌的侵袭和转移是肺癌的恶性标志和特征，也是导致肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。肺癌转移是一个多阶段、多基因参与的复杂过程，虽然目前对肺癌侵袭转移过程中的基因变化已经有了一些研究，但在相当长的时间内肺癌转移仍将是人类面临的亟待阐明和解决的重大基础和临床问题。利用分子生物学的新技术克隆和筛选新的转移相关基因，是解决肺癌转移问题的重点研究方向之一。抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)是新型的表型克隆方法，该技术简便易行、灵敏度高、重复性好，十分适于克隆分析某种特殊表型的目的基因及其功能。随着SSH技术的不断完善，它被越来越多地应用于肿瘤转移的相关研究中。本研究的目的就是应用SSH技术构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库，筛选、鉴定出转移相关基因的cDNA片段，为进一步克隆新的肺癌转移相关基因及探讨肺癌转移的分子生物学机制奠定基础。方法(1)应用SSH技术，以人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980和人高转移大细胞肺癌细胞株L9981为研究对象，构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库；(2)应用α互补原理，经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆，再应用PCR技术对阳性克隆进一步筛选；(3)应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选，确定差异表达片段对应的克隆；(4)对差异表达的片段进行序列分析；(5)将序列分析结果通过NCBI核苷酸数据库BLAST信息途径，进行同源性检索和比对，检索数据库包括：Human build 36 RNA alternate andreference assemblies，Database of GenBank+EMBL+DDBJ sequences fromEST Divisions和All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS,GSS,environmental samples or phase 0，1 or 2 HTGS sequences)。结果(1)成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库；(2)经蓝白菌落筛选和斑点杂交，正向消减文库获得307个阳性克隆，反向消减文库获得78个阳性克隆；(3)正向消减文库挑选55个克隆成功测序，经同源性分析最终确定差异表达基因片段23个与已知人类全长基因具有很高相似性(95％～100％)，这些基因包括NME2、NPM1、MT2A、HSPE1、TAFlA、EPRS、PX19和EIF3S9等；(4)反向消减文库挑选31个克隆成功测序，经同源性检索和比对最终确定差异表达基因片段16个，其中15个与人类全长基因具有很高相似性(95％～100％)，包括ANXA2、TUBB、PKN2、GNAS、EEF1A1、SSR2和RPLPO等基因。1个片段和己知人类基因仅有部分相似性，表明它可能是未被克隆的人类基因EST片段。成功向dbEST数据库提交，得到GenBank登录号ES452735。结论(1)应用抑制消减杂交技术成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库；(2)正向消减文库中筛选到的NME2、NPM1、MT 2A、HSPE1、TAF1A、EPRS、PX19和EIF3S9等基因在人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980中差异表达，这些基因的功能主要涉及细胞凋亡、调控转录、调控核糖体组装、抗氧化、清除自由基、负向调控Rho活性等，可能发挥着抑制肺癌转移的作用；(3)反向文库中筛选到的ANXA2、TUBB、PKN2、GNAS、EEF1A1、SSR2和RPLPO等基因在人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中差异表达，这些基因的生物学功能主要涉及基因转录、细胞骨架、蛋白质翻译及细胞信号传导等，可能发挥着促进肺癌转移的作用；(4)反向消减文库发现新EST片段，可能是一个与肺癌转移相关的新基因。