论文部分内容阅读
细胞周期蛋白(Cylins)能够激活依赖于细胞周期蛋白激酶(Cdk),并与其形成一个复合体调控细胞周期。高等真核生物细胞周期蛋白主要有8个家族(从Cyclin A到Cyclin H),每个家族包含若干个成员。不同的细胞周期蛋白在细胞周期中所起的作用各不相同,并且其序列差别很大,但都有约100个氨基酸的保守区域,称为周期蛋白框。其中,Cyclin A周期蛋白能够和CDK2、CDK1(CDC2)分别形成复合体,在细胞分裂分别进入S期和M期时起到重要作用。CyclinA1属于Cyclin A家族蛋白,在鼠科动物和人类的睾丸中有大量的表达。研究发现敲除小鼠Cyclin A1基因,会导致雄性小鼠不育,而且小鼠的睾丸只有在经历减数分裂过程时才会有Cyclin A1的表达,并且表达量非常高。这就说明Cyclin A1基因在减数分裂的过程中扮演着非常重要的角色。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是单细胞真核生物,属于纤毛类原生动物,在一个单细胞内集中了维持生命和延续后代所需要的一切功能,有着精细的细胞周期进程和核发育的过程,是研究细胞周期基因功能的理想体系。四膜虫在营养条件下进行无性生殖,在条件较差或者是用Tris饥饿的条件下能够进行有性生殖。其有性生殖包括减数分裂和有丝分裂,而细胞周期蛋白在减数分裂过程中起着什么样的作用,尚不清楚。本研究对嗜热四膜虫的细胞周期蛋白Cyc17基因功能进行研究,获得如下结果:1.嗜热四膜虫Cyc17基因的生物信息学分析我们从四膜虫全基因组数据库(Tetrahymena Genome Database,TGD,http://ciliate.org/)中筛选到Cyc17基因,基因全长1820bp,其中编码区域1558bp,编码519个氨基酸,拟编码蛋白分子量约为61.2KD;通过同源比对发现嗜热四膜虫Cyc17的氨基酸序列与已发表的其它物种的Cyclin A1氨基酸序列有较高的一致性,并包含有N-terminal和C-terminal功能域。因此,嗜热四膜虫Cyc17基因与CyclinA1为同源基因;表达谱分析发现,Cyc17基因在嗜热四膜虫营养生长时期和饥饿时期均不表达,而在接合生殖时期开始表达,并且在接合生殖6小时表达值最高。因此,我们推测Cyc17基因在嗜热四膜虫接合生殖前期具有重要功能。2.敲除嗜热四膜虫Cyc17基因我们构建了不同交配型嗜热四膜虫(CU428和CU427)Cyc17基因敲除株,将它们交配后观察不同时期的核发育情况,野生型细胞株作为对照组。得到的结果如下:(1)用DAPI染色观察其核发育,发现嗜热四膜虫敲除Cyc17基因之后,接合生殖时期的小核不能完成减数分裂过程。(2)荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization)实验证明ΔCyc17细胞株在减数分裂过程中能够完成同源重组事件;(3)Gimesa染色发现ΔCyc17细胞株接合生殖的小核发育停滞在Diakinesis-Metephase I时期;(4)我们检测ΔCyc17细胞株的后代存活率,发现其存活率为零。本研究首次在嗜热四膜虫中敲除了Cyc17基因,初步研究了其在四膜虫中的功能,对后续的研究工作具有参考价值。