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目的:HIV相关性痴呆(HIV associated dementia,HAD)是HIV-1感染者重要的神经系统并发症,患者症状包括记忆障碍,精神运动迟缓,注意力丧失,冷漠以及认知障碍。随着病情的加重,晚期会发生严重痴呆,昏迷和瘫痪。随着全球范围内高效抗反转录病毒疗法的广泛使用,一方面提高了 HIV患者的生存时间和生活质量,另一方面又使得艾滋病逐渐成为一种慢性病,从而增加了 AIDS相关的慢性神经系统并发症的发病率。目前研究认为HAD的发病机制与患者大脑神经细胞的损伤和凋亡有关,且其病情的发生和发展也与HIV-1的神经致病性以及患者免疫水平相关。HIV-1侵犯中枢神经系统(central nervous system,CNS)后,由于自身高变异特性和CNS独特的生理环境,造成了病毒在中枢与外周不同的变异情况。Vpr蛋白是HIV-1的辅助蛋白,可以通过与细胞内多种蛋白间复杂的互相作用,影响到宿主基因的表达,诱导神经细胞G2期停滞,并可以通过直接或者间接的方式导致神经细胞发生凋亡,是诱导HAD发生及发展的重要因素之一。为了探究HIV-1的vpr基因序列在患者中枢和外周的变异情况,以及vpr基因变异导致的氨基酸位点的变化致Vpr蛋白生物学活性的改变与HAD的关系,本文研究了一例HAD和一例非HAD患者中枢和外周HIV-lvpr基因序列变异,并构建了不同来源的vpr真核表达载体,探讨Vpr蛋白对小鼠神经瘤母细胞N2a细胞活性、周期阻滞和凋亡的影响及其作用机制,以期为HAD的致病机制提供新的思路。方法:1.HIV-1 vpr基因克隆及序列分析(1)HIV-1 vpr基因克隆 以一例HAD病人(H)与一例非HAD病人(N)外周部位的淋巴结(lymphnode,LN)、脾脏(spleen,SPL)、肝脏(liver,LIV)和中枢神经系统的颞叶皮质(temporal cortex,TC)、脑膜(meninges,MG)、额叶白质(white matter from frontal cortex,WM)、基底核(basal ganglia,BG)共十四个部位的尸检标本基因组DNA为模板,通过巢式PCR技术扩增HIV-1 vpr基因序列,并将扩增的目的基因连接到pMD19-T克隆载体上,转化进大肠杆菌感受态中,通过氨苄青霉素和蓝白斑试验筛选出阳性菌落(每个部位各5个)测序验证。(2)HIV-1 vpr序列分析 利用MEGA和Bioedit等生物学软件对测序成功的序列绘制系统进化树、计算基因距离和同义/非同义替换值以及分析氨基酸突变位点。2.HIV-1 Vpr蛋白对神经细胞活性、周期阻滞和凋亡的影响(1)pEGFP-N1-vpr真核表达载体的构建 根据测序结果选取中枢和外周变异较大的四个vpr基因片段(H-MG、H-SPL、N-MG、N-SPL)为模板,PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳回收,并通过限制性核酸内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ将目的基因与pEGFP-N1载体分别双酶切,回收产物,16℃连接过夜,将连接产物转化进大肠杆菌DH5 α感受态细胞中,接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养16～18h后,提取重组质粒测序鉴定。(2)HIV-1 Vpr在N2a细胞中的表达及鉴定 将真核表达载体pEGFP-N1-vpr转染N2a细胞,细胞对照组和空载体对照组分别为正常细胞组和pEGFP-N1空载体组。在荧光显微镜下观测,追踪,记录不同时间点绿色荧光蛋白的表达量来初步判断HIV-1 Vpr蛋白的表达情况,通过Western blot鉴定HIV-1 Vpr在N2a细胞中的表达。(3)HIV-1 Vpr蛋白对小鼠神经瘤母细胞N2a细胞活性、周期阻滞和凋亡的影响 转染48h后,采用CCK8试剂盒检测Vpr蛋白对N2a细胞活性的影响;采用流式细胞仪PI单标法分析HIV-1 Vpr蛋白对N2a细胞周期的影响,实验结果通过modfit软件处理;采用流式细胞仪Annexin V-7-AAD/PE双标法检测不同来源的Vpr蛋白对N2a细胞凋亡率的影响。3.统计学分析数据分析采用SPSS 18.0软件包。基因距离比较采用两两比较的t检验;各组N2a细胞活性、周期阻滞率和凋亡率的比较采用完全随机的单因素方差分析,若数据满足正态及方差齐,则组间比较采用LSD法;若数据满足正态但是方差不齐,则采用welch校正,组间比较采用Dunnett’s T3法。计量资料以(?)±S表示,P=0.05。结果:1.HIV-1 Vpr基因多态性及氨基酸序列分析(1)HIV-1 vpr基因克隆巢式PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,均在300bp处显示出明显条带,与预计(288bp)相符。测序后经BLAST鉴定为HIV-1 B亚型vpr基因序列。(2)HIV-1 vpr系统进化树分析由系统进化树可见,非HAD病人的7个部位来源的HIV-1 vpr基因序列在所绘制的系统进化树中的交叉较少,大多位于各自的进化枝上;而HAD病人的vpr基因序列在进化树中交叉较大,尤其是外周序列的进化树交叉非常明显,中枢部位仅存在TC和BG部位进化树的交叉。(3)基因距离分析基因距离分析结果显示,同一病人体内,中枢来源的vpr变异均小于其外周序列的变异,说明,在机体内不同环境因素的选择作用,也会影响病毒的变异情况。同时,HAD病人的vpr基因序列的距离较非HAD病人大,说明不同病人由于其感染病毒情况,机体免疫情况,疾病进展情况等的差异都会影响到HIV病毒的变异。(4)ds/dn值分析ds/dn值常用来描述分子进化中的突变率及其所受的选择压力。本研究结果显示,两例病人中ds/dn值均大于1,表明在HIV感染者体内,vpr基因变异均受到了负向选择的压力,且来源于非HAD病人中枢部位的基因其ds/dn值明显少于其他各组,差异有统计学意义(P＜0.05)。(5)HIV-1 Vpr氨基酸位点变异分析Vpr氨基酸序列分析表明,HAD和非HAD病人来源Vpr的氨基酸位点变异不同,对于同一病人而言,其CNS来源和外周来源Vpr蛋白的氨基酸变异的位点和频率也存在较大差异。HAD病人与非HAD病人相比,中枢部位的差异较少,仅有T84I、Q86R、R87S氨基酸变异;外周部位的差异较大,存在D7N、Q11P、R36M、I37V、H45Y、A55T、L67M、R77H、T84I、R85P、Q86R、R87S 共计12个氨基酸位点变异。2.HIV-1 Vpr蛋白对神经细胞活性、周期阻滞和凋亡的影响(1)pEGFP-N1-vpr真核表达载体的构建PCR扩增后产物经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳后,在300bp处显现出一明亮条带,与预期大小相符。取PCR产物送公司测序,后经BLAST测序确定为HIV-1 vpr 序列。(2)HIV-1 Vpr蛋白在N2a细胞中的表达及鉴定转染结果显示,空载体组绿色荧光蛋白亮度很强,表明质粒转染效率高,其余表达载体也皆可见绿色荧光蛋白。通过免疫印迹法检测Vpr蛋白表达的结果显示,细胞对照组和空载体对照组不表达Vpr蛋白,其余表达载体皆可正常表达Vpr蛋白,且表达量相近,无统计学差异。(3)HIV-1 Vpr蛋白对N2a细胞活性的影响细胞对照组和空载体对照组的N2a细胞的活性差异没有统计学意义,N-MG组与空载体对照组的N2a细胞活性差异也无统计学意义,而H-MG,H-SPL,N-SPL组细胞与空载体对照组相比,细胞活性降低,差异有统计学意义(P＜0.001),提示Vpr蛋白可能会引起细胞活性下降。而两两比较的结果显示,H-MG比N-MG有更强的抑制细胞活性的能力,差异有统计学意义(P＜0.05)。(4)HIV-1 Vpr蛋白对N2a细胞周期阻滞的影响空载体对照组和细胞对照组的周期阻滞率差异无统计学意义,表达Vpr蛋白的H-MG,H-SPL,N-SPL,N-MG4组细胞,其G2周期阻滞率显著高于空载组(P＜0.001)。在各实验组的比较中,H-MG的蛋白表现出最强的G2周期阻滞的能力(P＜0.05)。(5)HIV-1 Vpr蛋白对N2a细胞凋亡的影响空载组和空白组细胞凋亡差异无统计学意义,与空载组相比,表达Vpr蛋白H-MG,H-SPL,N-SPL,N-MG组细胞凋亡水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),提示Vpr蛋白可引起细胞凋亡。在各实验组的比较中,H-MG 比N-MG有更强的诱导细胞凋亡的能力,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:1.HAD和非HAD病人来源的HIV-1 vpr基因在系统进化树,基因距离分析,ds/dn值和氨基酸位点变异等方面存在较大差异,可能与HAD的发生和进展有关。2.HIV-1 Vpr蛋白可诱导N2a细胞G2期阻滞,诱导其凋亡,影响其细胞活性。且HAD病人中枢来源的Vpr蛋白显示出更强的神经毒性作用,这表明其氨基酸突变或增强了病毒蛋白的神经毒性,并可能与HIV-1的神经致病性有关。