论文部分内容阅读
目的:先天性白内障是儿童首位致盲性眼病,发病机制至今未明。研究表明50％与遗传因素有关,常染色体显性遗传是先天性白内障主要的遗传方式。本研究对40个不同表型先天性白内障家系进行致病基因定位和突变分析,然后利用生物物理学和细胞生物学手段研究致病突变对蛋白结构和功能的影响,分析其致病分子机制。
方法:在知情同意原则下收集不同表型常染色体显性遗传性白内障家系,进行详细的眼部检查及血样采集。利用等位基因共享、连锁分析、直接测序等分子遗传学策略进行致病基因定位及突变分析,并对发现的突变进行生物信息学预测。在此基础上,构建原核或真核表达体系,利用生物物理学、生物化学或细胞生物学手段研究突变对蛋白结构、功能、稳定性和聚集倾向的影响,解析其致病分子机制。
结果:收集不同表型常染色体显性遗传性白内障家系40个,表型分析核性白内障家系16个(40％),点片状白内障7个(17.5％),后极性白内障4个(10％),缝性白内障3个(7.5％),珊瑚状白内障3个(7.5％),粉尘状白内障1个(2.5％),板层白内障1个(2.5％),多态型白内障1个(2.5％),表型不确定4个(10％)。经连锁分析和突变筛查,在8个家系中发现致病突变,占所有家系20％:CRYAAR116H引起多态型白内障、CRYBB1 S129R引起核性白内障及小角膜、CRYBB1R233H引起核性白内障、CRYBB2 V146M引起核性白内障及小角膜、CRYBB2I21N引起核性白内障、GJA8 I31T引起核性白内障、GJA8 R76H引起核性白内障和虹膜缺损、MIPR187C引起核性白内障,其中除CRYAA R116H外,其他均为国内外首次报道。在已发现突变中以晶状体蛋白基因突变最多,占所有突变的62.5％(5/8),且8个突变家系均表现有核性白内障。生物信息学分析见所有突变在不同物种中均高度保守,且预测突变将影响蛋白质的功能或二级结构。CRYBB1 S129R体外原核诱导表达并纯化,生物物理学研究发现突变没有影响βB1-晶状体蛋白本身的折叠,而不同程度影响βB1-晶状体蛋白同聚体和βB1/βA3-晶状体蛋白异聚体的空间结构,更为重要的是,热聚集模型发现突变引起βB1/βA3-晶状体蛋白异聚体热稳定性降低,导致βA3-晶状体蛋白聚沉,而同聚体相对较为稳定。GJA8 R76H表达于Hela细胞,免疫印迹显示突变蛋白溶解性降低,虽然突变型蛋白与野生型蛋白均表达于细胞膜上,但是突变型细胞之间不能形成缝隙连接斑块,因此R76H突变可能影响细胞间缝隙连接通道的形成。
结论:国人常染色体显性遗传性白内障主要的临床表型为核性白内障,在16个核性白内障家系中发现5个晶状体蛋白基因突变和3个膜蛋白基因突变(占50％),可见晶状体蛋白基因和膜蛋白基因是核性白内障最主要的致病基因,这对建立白内障表型.基因型之间的联系和丰富人类白内障致病突变谱具有重要意义。基因突变引起的β-晶状体蛋白之间相互作用异常或蛋白本身功能性改变将导致先天性白内障发生,为进一步阐明先天性白内障发病机制提供科学依据。但是,在所有家系中,仍有高达80％的家系在已知基因中未发现致病突变,反映先天性白内障具有较强的遗传异质性,同时也将为寻找新的致病基因奠定基础。