猪附红细胞体特异性检测方法的建立及红细胞黏附蛋白的特性分析

• 作 者: 沈克飞
• 出 处: 吉林大学
• 发表日期: 2008年期
• 关键词: 猪附红细胞体 PCR 感染 红细胞 致病因子

多年来国内外对附红细胞体的分子生物学检测多根据附红细胞体16S rRNA基因设计的PCR引物进而对病原体DNA进行扩增检查。我们根据GenBank中登录的猪附红细胞体和牛附红细胞体16S rRNA基因的保守区域及猪附红细胞体的保守区域设计引物,对从疑似附红细胞体病猪血液提取的DNA样品进行PCR扩增,序列分析表明,所扩增出的DNA均非猪附红细胞体DNA。在多种病原混合感染的样品,16S rRNA基因并不是建立诊断附红细胞体感染的理想靶序列。我们根据猪附红细胞体特异DNA片段(AJ504999)设计了三个引物,利用FailSafe TM PCR 2×PreMixes试剂对PCR反应条件进行了优化,建立了检测猪附红细胞体的特异、敏感的半套式PCR方法。用该方法对临床样本的检测发现,我国猪附红细胞体总体感染率为70.67%,其中健康猪感染率为64.41%,临床上不明原因发烧等病猪的感染率为74.73%。序列分析显示,扩增片段与报道的猪附红细胞体序列(AJ504999)的同源性在99.63%以上,与其它病原生物无同源性。此外,通过序列分析发现猪附红细胞体特异DNA片段(AJ504999)的一个开放读码框架(ORF)编码一个含有跨膜结构域的蛋白质,根据工程菌大肠杆菌的密码子组成特点,化学合成了编码膜外区的DNA片段(msp)。将msp分成两部分msp1和msp2,分别克隆到pGEX-4T-1质粒中,进而在大肠杆菌内表达并纯化了含GST(谷胱苷肽-S-转移酶)的可溶性重组蛋白。对重组蛋白进行的红细胞结合实验表明,在MSP1和MSP2区域上存在两个独立的与红细胞表面GAG样受体分子结合的结构域。该研究结果为揭示猪附红细胞体与宿主红细胞黏附的分子机制奠定了基础。