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西尼罗河病毒是黄病毒科黄病毒属成员,与日本乙型脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和昆津病毒同属日本脑炎病毒血清群。该病毒是虫媒病毒,主要经库蚊传播给人、马和鸟类等,可引发西尼罗河热和致死性的西尼罗河病毒性脑膜脑炎,其中西尼罗河热被国际兽疫局列为重大疾病。西尼罗河病毒分布广泛,已在世界上许多国家和地区引起流行,造成人、马和鸟类的大量感染及死亡,给发病国家造成重大危害,成为全球兽医界和公共卫生部门的一大难题。我国目前还没有发现西尼罗河病毒,但存在传入的风险,因此建立快速、准确的检测方法对于我国预防该病毒的入侵具有重大意义。 本文建立了检测西尼罗河病毒的巢式反转录PCR、荧光定量RT-PCR技术。 本研究采用西尼罗河病毒的1999年北美分离株,针对该病毒的保守蛋白E基因设计了巢式反转录PCR的引物,引物经Blast和常规PCR鉴定具有很好的特异性。试验采用的RNA模板来自质粒DNA的体外转录产物。反应的第一步反转录PCR和第二步巢式PCR分别扩增出长度为445bp和248bp的两条片段。该法的特异性和敏感性均很好,可检测到拷贝数为6×10~0拷贝的病毒RNA。 荧光PCR反应产生实验室交叉污染的机率比巢式反转录PCR要低得多。本研究中,试验者建立了基于TaqMan探针的反转录荧光PCR技术,这种技术的最低敏感度达到3×10~1 RNA拷贝。本试验同样采用西尼罗河病毒的1999年纽约分离株进行研究,针对该病毒的E基因区设计了一对寡核苷酸引物和一条由FAM和TAMRA标记的特异性探针,反应的模板RNA来自质粒DNA的体外转录产物。试验过程中还对荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的敏感性进行了比较,结果表明荧光RT-PCR技术的特异性和敏感性均高于常规RT-PCR法。