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Notch信号通路是细胞间一种保守的具有调节细胞增殖、分化和凋亡能力的信号机制。已有研究证实,造血干细胞的Notch信号通路通过细胞表面受体与其配体Jagged或Delta相结合而激活,从而对其在我更新和分化方面起着至关重要的作用。近年来的研究表明,Notch信号通路在牙齿的修复过程中起着关键性的作用,牙齿受损诱发其受体、配体表达,参与Notch信号通路与牙髓干细胞向血管周细胞和成牙本质细胞的分化过程。根据已有的研究,认为在造血干细胞中,Notch信号通路的激活会促使造血干细胞自我更新加快并抑制其分化。然而,在牙髓细胞中Notch信号通路的功能机制如何仍需进一步研究证实。
牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)的概念由Gronthos在2000年提出,其来源于牙髓组织,被认为是成人牙髓组织的前体,在正常或病理状态下具有分化成成牙本质细胞的潜能。已有研究证实,在体外培养的人牙髓干细胞中具有Notch信号通路的表达。因此,本实验利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术下调人牙髓干细胞中的Notch配体Deltal的表达,研究分析了其对细胞增殖和分化的影响。
方法:
1.细胞培养与鉴定:牙髓干细胞来源于临床上因正畸或阻生而拔除的健康牙齿,采用酶消化法分离获得并常规原代并传代培养;镜下观察细胞形态及其克隆形成能力;利用免疫组化及流式细胞术检测细胞表型,如Vimentin、GFAP、Nestin和collagentypeⅢ,以及间充质干细胞标志STRO-1;将细胞在成牙本质诱导条件下培养,观察其分化潜能。
2.慢病毒感染:牙髓干细胞被携带Deltal特异性RNAi的慢病毒感染,通过Western blot、RT-PCR检测DPSCs中Deltal基因及Notch通路靶基因Hesl的表达。实验将细胞分成三组,包括由携带Deltal特异性RNAi慢病毒感染的DPSCs/Deltal-RNAi组,由空慢病毒感染的DPSCs/vector组和正常细胞对照DPSCs/wt组。
3.细胞增殖与分化的检测:DPSCs中Deltal被干扰下调后,通过细胞周期、CCK-8和细胞核增殖抗原(PCNA)的Western blot检测细胞增殖能力;将细胞成牙本质诱导培养后,利用碱性磷酸酶活性、茜素红钙化结节染色和DSPP的Western blot检测细胞分化改变。
结果:
1.连续培养的人牙髓干细胞增殖快,单个细胞保持有2-4突起的梭形或星形;细胞具有克隆形成能力,CFU-F计数为2～15clones/103 cell;免疫组化及流式细胞术检测显示有Vimentin、GFAP、nestin和STRO-1的表达。经成牙本质诱导培养后,细胞出现了牙本质涎磷蛋白DSPP的表达,并有钙化结节形成。
2.DPSCs/Deltal-RNAi组的Deltal表达低于DPSCs/vector组和DPSCs/wt组,而DPSCs/vector组和DPSCs/wt组的Deltal表达没有明显区别。
3.DPSCs/Deltal-RNAi组的细胞增长率和S期及PCNA表达明显低于DPSCs/vector组和DPSCs/wt组。与DPSCs/vector组和DPSCs/wt组相比,DPSCs/Deltal-RNAi组细胞可形成较多钙化结节,碱性磷酸酶、DSPP检测明显增高。另外,DPSCs/Deltal-RNAi组的细胞形态发生改变。
结论:
1.从人牙髓组织中分离培养得到的细胞在体外具有一定的克隆形成能力,其表面分子的表达情况与文献报道相似,诱导条件下具有分化潜能,符合成体干细胞特性。
2.人牙髓干细胞被携带Deltal特异性RNAi慢病毒感染后,其Deltal和Notch通路可呈稳定低表达。
3.DPSCs/Deltal-RNAi组牙髓干细胞较DPSCs/wt组和DPSCs/vector组在相同诱导条件下,更易向成牙本质细胞分化。
4.Notch信号通路对细胞的自我更新和分化起着重要作用,Notch配体Deltal基因的低表达对细胞增殖具有抑制作用,并促进细胞在成牙本质诱导条件下向成牙本质细胞分化的能力。