论文部分内容阅读
星形胶质细胞是神经系统中数量最多的一类细胞，是大脑结构和功能的基石，参与神经元新陈代谢、突触形成、神经保护、大脑内稳态等过程。星形胶质细胞发生是胚胎发育后期的重要事件，与多种神经疾病的发生有关。准确认识星形胶质细胞发生过程，有助于神经疾病病理学研究。自噬是高度保守的细胞内防御性机制，可以清除错误折叠蛋白、异常细胞器或毒性大分子物质，自噬失调可引起神经退行性疾病等多种病症。多种自噬相关蛋白调控自噬发生过程，其中Atg5与Atg12、Atg16形成复合物，在自噬泡的形成过程中至关重要。研究显示，自噬在胚胎发育过程中是活跃的。但是，目前关于自噬是否调控、如何调控胚胎发育后期星形胶质细胞发生等关键问题，还没有明确答案。 在本文中，通过功能获得和功能缺失实验，研究了自噬相关基因Atg5及其介导的自噬过程在星形胶质细胞发生过程中的作用。首先，检测了在正常胚胎发育过程中自噬与星形胶质细胞发生之间的相关性。免疫印迹和免疫染色结果显示在胚胎大脑发育晚期星形胶质细胞发生的起始与Atg5蛋白表达量及自噬水平的变化相对应，暗示自噬可能参与调控星形胶质细胞发生。为进一步研究自噬与星形胶质细胞发生之间的联系，构建了Atg5敲降及过表达质粒并进行了一系列体外、体内实验。结果显示:敲降Atg5阻抑了星形胶质细胞的发生，而过表达Atg5促进了星形胶质细胞的发生。过表达人Atg5可以使敲降小鼠Atg5后星形胶质细胞发生缺陷现象得到部分恢复。体外使用Cre病毒、体内使用胚胎电转Cre质粒对Atg5(f/f)小鼠进行了条件性敲除实验，发现敲除Atg5后，星形胶质细胞发生过程严重受损，这与敲降实验结果一致。 进一步，我们研究了Atg5介导的自噬过程是否通过激活调控神经胶质细胞发生的经典通路——JAK-STAT通路而发挥作用的。结果显示敲降Atg5后，pJAK2/JAK2和pSTAT3/STAT3比值下降;过表达Atg5后结果反之。体内过表达STAT3-C（STAT3持续激活，A661C/N663C）可以有效逆转敲降Atg5时星形胶质细胞发生缺陷的现象。这些数据证实了Atg5介导的自噬调控了星形胶质细胞发生。白噬的主要功能是降解物质，那么Atg5介导的自噬通过降解哪种抑制分子而激活JAK-STAT通路？经筛选得到候选分子SOCS2，结果显示敲降或过表达Atg5改变了细胞中SOCS2的含量。在SOCS2 shRNA和Atg5 shRNA共同存在时，pSTAT3/STAT3比值、GFAP阳性细胞数都有所增加。免疫共沉淀结果显示:在正常条件或饥饿刺激下，SOCS2与自噬标识物LC3结合;加入自噬抑制物(E64d+pepstatinA)后，被检测到的SOCS2（与LC3结合）含量增多。这些证据表明Atg5介导的自噬通过降解SOCS2激活JAK2-STAT3信号通路，增强相关基因表达，促进星形胶质细胞的发生。 在此，首次证实自噬相关基因Atg5及其介导的自噬在星形胶质细胞发生中的调控作用及其内在分子机制，这有助于更好地理解自噬在胚胎大脑发育中的作用，深化对神经胶质细胞发生过程的认识，为寻找神经退行性疾病治疗新靶点提供理论依据，也为优化神经疾病中神经干细胞移植治疗提供新策略。