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肾脏病是我国的常见病和多发病。作为肾脏病的一个主要临床症状，蛋白尿在疾病诊断、判断疗效、决定预后上起着非常重要的作用。但是，对蛋白尿本质的认识，人们经历了从临床综合征，到组织形态学，再到细胞分子学的一个不断深化的过程。在蛋白尿的形成过程中，肾小球滤过膜是一道重要的屏障，而其中足细胞扮演着十分重要的角色。肾小球足细胞病变是膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化和糖尿病肾病等共同的病理生理基础。足细胞损伤导致的大量蛋白尿也是上述肾病患者肾功能进行性恶化的重要因素，目前临床上缺乏有效的治疗方法。
南京解放军肾脏病研究所首次将雷公藤应用于肾炎病人的治疗。三十多年的临床实践进一步肯定了它独特的疗效。临床研究表明，雷公藤多甙对微小病变的缓解率达75％，双倍剂量治疗原发性肾病综合征总缓解率达83％，而且对难治性肾病综合征同样有较高的缓解率。一些膜性肾病和部分对激素无效的FSGS病人，雷公藤多甙能明显减少蛋白尿，缓解症状。应用雷公藤治疗的肾病病例，伴随着蛋白尿的减轻常可出现尿蛋白组成成分的变化。凝胶电泳显示原高分子蛋白尿者可以转变为中分子蛋白尿，尿中原有的C3及/或α2巨球蛋白也可以消失，说明雷公藤有可能改变肾小球滤过屏障的通透性(6)。Sharma通过测量体外分离的肾小球在药物作用下的体积改变，发现雷公藤多甙能改善多种诱导因素(TNF-a，超氧化物，FSGS患者血清)导致的肾小球对白蛋白的通透性增加，为雷公藤对肾小球滤过屏障的作用提供了直接的证据(14)。
雷公藤甲素是从雷公藤中提取到的主要活性物质，系一种环氧二萜单体成分。是目前临床应用的雷公藤多甙片的主要成分。在人膜性肾病的经典模型—被动型Heymann肾炎大鼠模型(PHN)的研究中，我们发现，雷公藤甲素能非常显著地减少Heymann肾炎大鼠的蛋白尿，减轻肾组织免疫损伤，尤为重要的是，免疫病理和超微结构分析发现，经雷公藤甲素治疗后，足细胞足突损伤明显减轻，足突融合显著改善，足细胞裂孔膜关键分子如nephrin和podocin的表达水平明显增加，分布形态也从颗粒状不连续分布变为正常连续性分布，提示雷公藤甲素能直接改善和修复足细胞病变。由于Heymann肾炎是免疫因素介导足细胞损伤所致，因此雷公藤甲素对足细胞的治疗作用尚不能排除其免疫抑制活性的影响。在氨基核苷嘌呤霉素(PAN)介导的非免疫性足细胞病变大鼠模型中，进一步证实了雷公藤甲素对蛋白尿的治疗作用和对足细胞损伤的影响。
本论文运用体外足细胞损伤研究模型(氨基核苷嘌呤霉素模型、C5b-9插入模型、血管紧张素Ⅱ模型)，对雷公藤甲素的疗效特点，其对足细胞结构、功能以及作用的信号通路分子等问题进行研究，以阐明雷公藤甲素保护足细胞的作用机制。
本研究由三部分组成研究一、雷公藤甲素干预氨基氨基核苷嘌呤霉素诱导足细胞损伤的体外研究雷公藤甲素对嘌呤霉素肾病大鼠的疗效及对足细胞病变的改善提示，雷公藤甲素有可能直接用于足细胞，从而改善其病变状况。本研究借助氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PAN)致足细胞损伤体外模型，观察了雷公藤甲素对足细胞损伤的保护和修复作用，并对其作用机制进行了研究。
在观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用研究中，雷公藤甲素与足细胞预孵育30min后，再加入含PAN的培养基，继续作用24h;观察雷公藤甲素对足细胞损伤的修复作用研究中，PAN作用足细胞24小时，造成足细胞明显损伤后，再加入含或不含雷公藤甲素的培养基，继续培养3天。免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和synaptopodin，裂孔膜相关分子nephrin和podocin在足细胞的分布及表达量的变化。并进一步观察了细胞内活性氧(ROS)及其下游p38 MAPK信号通路，以及细胞内调节骨架装配的RhoA信号通路的活性，即采用流式细胞仪分析荧光探针CM-H2DCFDA标记的细胞内活性氧，western blot检测p-38 MAPK磷酸化水平，pull down方法检测RhoA活性。
结果发现:正常分化足细胞F-actin呈丝状结构，密度大，丝强劲有力，沿细胞极性分布;synaptopodin呈颗粒状沿细胞骨架分布。裂孔膜蛋白nephrin沿足细胞膜和细胞骨架分布，podocin呈线状均匀分布于胞浆内，PAN作用24h小时后，细胞足突回缩，F-actin几乎完全解聚，synaptopodin表达消失。Nephrin和podocin表达减弱，正常丝状结构消失。而经过雷公藤甲素的预处理，PAN诱导的足细胞损伤明显减弱，足细胞未表现出上述骨架结构的改变，synaptopodin表达没有明显减弱。同时我们的结果显示，在PAN造成足细胞明显损伤后再加入雷公藤甲素，足细胞损伤能够得到一定修复，细胞内重新出现极性分布的微丝，同时，synaptopodin的表达也得以修复。对细胞内活性氧及其下游的MAPK信号通路、细胞骨架相关信号通路RhoA研究显示，100μg/ml PAN可诱导足细胞内ROS的明显增加，激活p-3s MAPK信号通路;同时PAN可明显降低RhoA活性。雷公藤甲素(10ng/ml)能有效遏制细胞内ROS的产生和p38 MAPK的活化，并维持足细胞RhoA通路的活性。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)(10 mmol/L)预处理细胞后，能够有效遏制PAN诱导的细胞内ROS的产生，抑制p38 MAPK信号通路的活化。RhoA信号通路选择性抑制剂C3转化酶可阻断雷公藤对足细胞骨架结构的保护作用。
该部分研究表明:雷公藤甲素可稳定足细胞的细胞骨架，拮抗PAN对足细胞的损伤。在足细胞损伤已经发生后，雷公藤甲素可逆转足细胞的损伤，修复足细胞骨架结构和相关分子的表达。雷公藤甲素的上述作用与细胞内ROS-p38 MAPK和RhoA信号通路密切相关。雷公藤甲素对足细胞的影响可能是其降低肾小球肾炎患者尿蛋白的重要机制之一。
研究二、雷公藤甲素干预C5b-9诱导足细胞损伤的体外研究临床上雷公藤多苷片治疗特发性膜性肾病疗效肯定，是治疗特发性膜性肾病的有效疗法之一。在被动型Heymann肾炎大鼠模型和人类膜性肾病中，膜攻击复合物C5b-9介导了肾小球足细胞的损害及蛋白尿的形成。体外研究发现雷公藤甲素对足细胞损伤有直接的保护和修复作用，可拮抗氨基核苷嘌呤霉素对足细胞的损伤，稳定足细胞的骨架结构。那么，雷公藤甲素是否可直接拮抗C5b-9导致的足细胞损伤?本研究借助小鼠足细胞系，体外观察了雷公藤甲素对C5b-9诱导的足细胞损伤的保护作用，并探讨其作用机制。
以纯化的C5b6及C7～C9体外组装C5b-9，建立足细胞亚溶破模型。免疫荧光染色分析C5b-9对足细胞骨架相关蛋白F-actin表达和分布的影响;在观察雷公藤甲素对C5b-9导致的足细胞损伤的治疗机制研究中，免疫荧光观察和流式细胞仪定量分析雷公藤甲素对C5b-9在足细胞膜上组装和活性的影响。并进一步在C5b-9组装完成后加入雷公藤甲素，观察雷公藤甲素对C5b-9诱导的足细胞内活性氧(ROS)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响。流式细胞仪分析荧光探针CM-H2DCFDA标记的细胞内活性氧，MAPK信号通路的活性采用Westernblot检测p-38，ERK1/2和JNK MAPK磷酸化水平，以及MAPK信号通路选择性阻断剂SB203580，U0126和SP600125对C5b-9作用的影响。
结果发现:免疫荧光和LDH释放试验显示C5b-9在足细胞膜组装成功，亚溶解剂量C5b-9对足细胞膜完整性没有明显影响，但可呈时间依赖性的破坏足细胞骨架结构，表现为细胞骨架的极性消失，排列紊乱，部分足细胞F-actin的丝状结构完全消失。C5b-9可诱导足细胞内ROS的明显增加，激活p-38 MAPK信号通路，但C5b-9对ERK MAPK和INK MAPK信号通路没有明显的影响。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、p-38 MAPK通路特异性抑制剂SB203580均能够拮抗C5b-9对足细胞的损伤，而ERK MAPK和JNK MAPK通路抑制剂U0126和SP600125对C5b-9诱导的足细胞损伤没有明显的保护作用。雷公藤甲素(10ng/ml)对C5b-9复合物在足细胞膜上组装量和活性没有明显的影响。当C5b-9在足细胞膜上组装完成后加入雷公藤甲素，雷公藤甲素对C5b-9诱导的细胞内ROS的产生没有明显的抑制作用，但能够有效遏制p-38 MAPK信号通路的活化，p-38 MAPK的磷酸化水平显著降低。
该部分研究表明，雷公藤甲素的疗效机制除了免疫抑制和抗炎作用外，还可通过抑制C5b-9激活的细胞内p-38 MAPK信号通路发挥直接的足细胞保护作用。雷公藤甲素对足细胞的上述作用可能部分参与了其对膜性肾病的疗效。
研究三、雷公藤甲素对血管紧张素Ⅱ诱导足细胞损伤的保护作用及其机制研究血管紧张素可直接作用于足细胞，参与了多种肾小球疾病的进展。AngⅡ作为足细胞损伤治疗的靶点，抑制AngⅡ的产生或抑制其与受体的结合的药物可以延缓肾小球疾病的进展，该保护作用并不依赖于药物对血压的影响。由于雷公藤甲素对肾小球疾病具有广泛的治疗作用，我们探讨了雷公藤甲素对对AngⅡ诱导的足细胞损伤的保护作用，并探讨其作用机制。
AngⅡ(10-6，10-7，10-8mol/L)作用分化足细胞2h;在观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用研究中，不同浓度雷公藤甲素(1，3，10ng/ml)与足细胞预孵育30min后，再加入含AngⅡ(10-7 mol/L)的培养基，继续作用2h。免疫荧光染色分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和细胞间连接蛋白ZO-1表达和分布的变化，流式细胞仪分析荧光探针CM-H2DCFDA标记的细胞内活性氧，并进一步观察了ROS下游MAPK信号通路的活性，即采用western blot检测p-38，ERK1/2和JNKMAPK磷酸化水平，以及MAPK信号通路选择性阻断剂SB203580，U0126和SP600125对AngⅡ作用的影响。
研究结果显示:ATⅡ可呈剂量依赖性的破坏足细胞骨架结构和细胞间连接，表现为F-actin在胞浆中的应力纤维解聚，F-actin的边聚。细胞间连接的断裂，细胞皱缩。雷公藤甲素呈剂量依赖性的抵御ATⅡ对足细胞的损伤，10ng/ml的作用最为明显，表现为拮抗AngⅡ诱导的骨架蛋白解聚，拮抗AngⅡ诱导的细胞间连接分子的重排。细胞内活性氧及其下游的MAPK信号通路研究显示，AngⅡ(10-7mol/L)可诱导足细胞内ROS的明显增加，激活p-38，ERK和JNK三条MAPK信号通路，雷公藤甲素(10ng/ml)或抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)(10 mmol/L)预处理细胞后，能够有效遏制AngⅡ诱导的细胞内ROS的产生，抑制MAPK信号通路的活化。抗氧化剂NAC、p-38和ERK MAPK通路特异性抑制剂SB203580、U0126能够阻断AngⅡ对足细胞的损伤。
该部分研究表明，雷公藤甲素可稳定足细胞的骨架结构和细胞间连接，拮抗AngⅡ对足细胞的损伤。雷公藤甲素的上述作用与细胞内ROS及下游的p-38、ERKMAPK信号通路密切相关。雷公藤甲素干预AngⅡ诱导的足细胞损伤可能部分参与了其对肾小球疾病的疗效。