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研究背景与目的：
顺铂是一种临床常用的高效化疗药物，其被应用于多个系统的恶性肿瘤化疗中。然而顺铂造成的毒副反应较多，例如耳毒性、肾毒性和神经毒性等。耳毒性是较为常见的并发症之一，在顺铂化疗的患者中高达80%左右可出现感音性耳聋。由于顺铂在临床上仍无可替代的药品，因此如何防治顺铂造成的耳毒性成为临床与基础研究的热点。银杏叶提取物在临床上被常用于心脑血管疾病、阿尔兹海默病、改善免疫状态、清除氧自由基等。然而银杏叶提取物在顺铂诱导的耳毒性中的作用研究甚少。本研究旨在探索银杏叶提取物在预防和治疗顺铂造成的耳毒性方面的作用及潜在分子机制。
研究方法：
(1)复苏及培养耳蜗毛细胞HEI-OC1细胞，将细胞分为5组。即对照组(Control)、顺铂组(Cis)、低浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE/L25μg/ml)、中浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE/M50μg/ml)、高浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE/H100μg/ml)。对照组细胞则不加入任何药物及化学试剂，仅加入高糖DMEM培养基(10%胎牛血清)培养。顺铂组细胞中加入8μg/ml顺铂进行干预24小时。银杏+顺铂组预先给予HEI-OC1细胞加入25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml银杏提取物先作用24小时，后再加入8μg/ml顺铂作用24小时。采用AMPK抑制剂(Dorsomorphin 2HCl)和SIRT1抑制剂(EX 527)分别对中浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE50μg/ml)细胞进行干预，Dorsomorphin2HCl的作用浓度为4μM，EX527的作用浓度为1μM。
(2)采用CCK-8试剂盒对五组HEI-OC1细胞的增殖活性进行检测。采用流式细胞术检测各组HEI-OC1细胞凋亡情况。采用SOD、CAT、GSH-Px、MDA试剂盒检测五组HEI-OC1细胞的氧化应激水平。
(3)Westernblot检测五组细胞AMPK、SIRT1、Bax、caspase-3等蛋白表达情况。
(4)动物实验部分将27只C57小鼠随机分成3组，每组9只。即正常对照组(每天腹腔注射80μl的生理盐水)，连续注射七天。顺铂组(腹腔注射顺铂4mg/kg/d)，连续注射7天。银杏+顺铂组则在注射顺铂前两日给予14mg/kg/d银杏叶提取物腹腔注射，连续注射两日。后连续7天腹腔注射顺铂注射液，4mg/kg/d，同时在给予14mg/kg/d银杏叶提取物注射液腹腔注射。
(5)听觉脑干反应阈值测试检测三组小鼠Ⅲ波阈值、振幅及潜伏期。
(6)实验干预结束后处死小鼠，收集血液后离心获得血清，SOD、CAT、GSH-Px、MDA试剂盒检测三组小鼠血清中氧化应激水平。Westernblot检测小鼠耳蜗内软组织AMPK/SIRT1信号通路表达水平。
研究结果：
(1)五组细胞增殖情况在第48、72、96小时均存在统计学差异(P＜0.05)。然而在第48小时，不同浓度的银杏+顺铂组之间增殖水平无明显差异(P＞0.05)，但均高于顺铂组(P＜0.05)，且均低于对照组(P＜0.05)。在培养第72小时和96小时，中浓度银杏+顺铂组和高浓度银杏+顺铂组的增殖水平与对照组无统计学差异(P＞0.05)，但高于低浓度银杏+顺铂组和顺铂组(P＜0.05)。
(2)对照组细胞凋亡率为(2.3±0.2)%，凋亡率显著低于顺铂组的(26.8±4.3)%。低浓度银杏+顺铂组、中浓度银杏+顺铂组和高浓度银杏+顺铂组的HEI-OC1细胞凋亡率分别为(8.9±2.1)%、(7.2±1.5)%、(7.3±1.2)%，均显著低于顺铂组，且高于对照组(P＜0.05)。
(3)对照组HEI-OC1细胞SOD、CAT、GSH-px水平分别为(14.3±2.3)mmol/mg，(18.5±2.5)U/mg，(14.2±1.7)μmol/mg，均显著高于顺铂组(P＜0.05)。而对照组HEI-OC1细胞的MDA水平为(1.7±0.2)mmol/mg，显著低于顺铂组(P＜0.05)。中浓度银杏+顺铂组和高浓度银杏+顺铂组的HEI-OC1细胞SOD、CAT、GSH-px水平显著高于低浓度银杏+顺铂组及顺铂组(P＜0.05)，且与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。
(4)顺铂组HEI-OC1细胞的凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平较其余各组显著升高(P＜0.05)，而Bcl-2水平则显著低于其余各组(P＜0.05)。高、中、低银杏+顺铂组细胞的p-AMPK和Sirt1的相对水平较顺铂组均有不同程度的升高(P＜0.05)。高、中、低银杏+顺铂组细胞的p-AMPK/AMPK比值与对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(5)AMPK抑制剂组和SIRT1抑制剂组的p-AMPK/AMPK比值均显著小于其余各组(P＜0.05)，而中浓度银杏+顺铂组HEI-OC1细胞的p-AMPK/AMPK比值及SIRT1的表达则显著提高(P＜0.05)，与对照组差异并无统计学意义(P＞0.05)。
(6)顺铂组小鼠在阈值及潜伏期方面均显著升高，并且高于对照组和银杏+顺铂组(P＜0.05)，而振幅则显著减少，低于对照组和银杏+顺铂组(P＜0.05)。
(7)对照组和银杏+顺铂组小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px水平均显著高于顺铂组(P＜0.05)，MDA水平则显著低于顺铂组(P＜0.05)。
(8)顺铂组耳蜗软组织的凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平较其余各组显著升高(P＜0.05)，而Bcl-2水平则显著低于其余各组(P＜0.05)。银杏+顺铂组的p-AMPK和SIRT1的相对水平较顺铂组升高(P＜0.05)。
研究结论：
(1)顺铂能够抑制HEI-OC1细胞增殖、促进凋亡，增加HEI-OC1细胞的氧化应激水平。
(2)不同浓度银杏叶提取物均能够有效的改善顺铂诱导的细胞增殖抑制、凋亡增加和氧化应激水平升高。并且中浓度和高浓度银杏叶提取物改善效果优于低浓度。
(3)银杏叶提取物能够通过AMPK/SIRT1信号通路途径抑制顺铂诱导的小鼠耳蜗毛细胞HEI-OC1的损伤与凋亡。
(4)顺铂能够造成小鼠听力损失，波Ⅲ的阈值和潜伏期增加、振幅下降。银杏叶提取物同时干预能够扭转顺铂造成的听力损失，改善波Ⅲ的阈值、潜伏期及振幅。
(5)银杏叶提取物能够改善顺铂诱导的小鼠血清氧化应激水平升高。
(6)银杏叶提取物能够通过激活AMPK/SIRT1信号通路抑制顺铂诱导的小鼠耳蜗内软组织细胞的凋亡和损伤。
顺铂是一种临床常用的高效化疗药物，其被应用于多个系统的恶性肿瘤化疗中。然而顺铂造成的毒副反应较多，例如耳毒性、肾毒性和神经毒性等。耳毒性是较为常见的并发症之一，在顺铂化疗的患者中高达80%左右可出现感音性耳聋。由于顺铂在临床上仍无可替代的药品，因此如何防治顺铂造成的耳毒性成为临床与基础研究的热点。银杏叶提取物在临床上被常用于心脑血管疾病、阿尔兹海默病、改善免疫状态、清除氧自由基等。然而银杏叶提取物在顺铂诱导的耳毒性中的作用研究甚少。本研究旨在探索银杏叶提取物在预防和治疗顺铂造成的耳毒性方面的作用及潜在分子机制。
研究方法：
(1)复苏及培养耳蜗毛细胞HEI-OC1细胞，将细胞分为5组。即对照组(Control)、顺铂组(Cis)、低浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE/L25μg/ml)、中浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE/M50μg/ml)、高浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE/H100μg/ml)。对照组细胞则不加入任何药物及化学试剂，仅加入高糖DMEM培养基(10%胎牛血清)培养。顺铂组细胞中加入8μg/ml顺铂进行干预24小时。银杏+顺铂组预先给予HEI-OC1细胞加入25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml银杏提取物先作用24小时，后再加入8μg/ml顺铂作用24小时。采用AMPK抑制剂(Dorsomorphin 2HCl)和SIRT1抑制剂(EX 527)分别对中浓度银杏+顺铂组(Cis+GBE50μg/ml)细胞进行干预，Dorsomorphin2HCl的作用浓度为4μM，EX527的作用浓度为1μM。
(2)采用CCK-8试剂盒对五组HEI-OC1细胞的增殖活性进行检测。采用流式细胞术检测各组HEI-OC1细胞凋亡情况。采用SOD、CAT、GSH-Px、MDA试剂盒检测五组HEI-OC1细胞的氧化应激水平。
(3)Westernblot检测五组细胞AMPK、SIRT1、Bax、caspase-3等蛋白表达情况。
(4)动物实验部分将27只C57小鼠随机分成3组，每组9只。即正常对照组(每天腹腔注射80μl的生理盐水)，连续注射七天。顺铂组(腹腔注射顺铂4mg/kg/d)，连续注射7天。银杏+顺铂组则在注射顺铂前两日给予14mg/kg/d银杏叶提取物腹腔注射，连续注射两日。后连续7天腹腔注射顺铂注射液，4mg/kg/d，同时在给予14mg/kg/d银杏叶提取物注射液腹腔注射。
(5)听觉脑干反应阈值测试检测三组小鼠Ⅲ波阈值、振幅及潜伏期。
(6)实验干预结束后处死小鼠，收集血液后离心获得血清，SOD、CAT、GSH-Px、MDA试剂盒检测三组小鼠血清中氧化应激水平。Westernblot检测小鼠耳蜗内软组织AMPK/SIRT1信号通路表达水平。
研究结果：
(1)五组细胞增殖情况在第48、72、96小时均存在统计学差异(P＜0.05)。然而在第48小时，不同浓度的银杏+顺铂组之间增殖水平无明显差异(P＞0.05)，但均高于顺铂组(P＜0.05)，且均低于对照组(P＜0.05)。在培养第72小时和96小时，中浓度银杏+顺铂组和高浓度银杏+顺铂组的增殖水平与对照组无统计学差异(P＞0.05)，但高于低浓度银杏+顺铂组和顺铂组(P＜0.05)。
(2)对照组细胞凋亡率为(2.3±0.2)%，凋亡率显著低于顺铂组的(26.8±4.3)%。低浓度银杏+顺铂组、中浓度银杏+顺铂组和高浓度银杏+顺铂组的HEI-OC1细胞凋亡率分别为(8.9±2.1)%、(7.2±1.5)%、(7.3±1.2)%，均显著低于顺铂组，且高于对照组(P＜0.05)。
(3)对照组HEI-OC1细胞SOD、CAT、GSH-px水平分别为(14.3±2.3)mmol/mg，(18.5±2.5)U/mg，(14.2±1.7)μmol/mg，均显著高于顺铂组(P＜0.05)。而对照组HEI-OC1细胞的MDA水平为(1.7±0.2)mmol/mg，显著低于顺铂组(P＜0.05)。中浓度银杏+顺铂组和高浓度银杏+顺铂组的HEI-OC1细胞SOD、CAT、GSH-px水平显著高于低浓度银杏+顺铂组及顺铂组(P＜0.05)，且与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。
(4)顺铂组HEI-OC1细胞的凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平较其余各组显著升高(P＜0.05)，而Bcl-2水平则显著低于其余各组(P＜0.05)。高、中、低银杏+顺铂组细胞的p-AMPK和Sirt1的相对水平较顺铂组均有不同程度的升高(P＜0.05)。高、中、低银杏+顺铂组细胞的p-AMPK/AMPK比值与对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(5)AMPK抑制剂组和SIRT1抑制剂组的p-AMPK/AMPK比值均显著小于其余各组(P＜0.05)，而中浓度银杏+顺铂组HEI-OC1细胞的p-AMPK/AMPK比值及SIRT1的表达则显著提高(P＜0.05)，与对照组差异并无统计学意义(P＞0.05)。
(6)顺铂组小鼠在阈值及潜伏期方面均显著升高，并且高于对照组和银杏+顺铂组(P＜0.05)，而振幅则显著减少，低于对照组和银杏+顺铂组(P＜0.05)。
(7)对照组和银杏+顺铂组小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px水平均显著高于顺铂组(P＜0.05)，MDA水平则显著低于顺铂组(P＜0.05)。
(8)顺铂组耳蜗软组织的凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平较其余各组显著升高(P＜0.05)，而Bcl-2水平则显著低于其余各组(P＜0.05)。银杏+顺铂组的p-AMPK和SIRT1的相对水平较顺铂组升高(P＜0.05)。
研究结论：
(1)顺铂能够抑制HEI-OC1细胞增殖、促进凋亡，增加HEI-OC1细胞的氧化应激水平。
(2)不同浓度银杏叶提取物均能够有效的改善顺铂诱导的细胞增殖抑制、凋亡增加和氧化应激水平升高。并且中浓度和高浓度银杏叶提取物改善效果优于低浓度。
(3)银杏叶提取物能够通过AMPK/SIRT1信号通路途径抑制顺铂诱导的小鼠耳蜗毛细胞HEI-OC1的损伤与凋亡。
(4)顺铂能够造成小鼠听力损失，波Ⅲ的阈值和潜伏期增加、振幅下降。银杏叶提取物同时干预能够扭转顺铂造成的听力损失，改善波Ⅲ的阈值、潜伏期及振幅。
(5)银杏叶提取物能够改善顺铂诱导的小鼠血清氧化应激水平升高。
(6)银杏叶提取物能够通过激活AMPK/SIRT1信号通路抑制顺铂诱导的小鼠耳蜗内软组织细胞的凋亡和损伤。