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鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种肠道致病菌，它是一种细胞内侵袭性细菌。利用侵袭性胞内细菌作为载体传递外源抗体基因疫苗是目前基因免疫研究的热点。它可将质粒DNA直接呈递给抗原提呈细胞(APC)，携带质粒DNA的细菌在APC的作用下发生溶解，或以宿主吞噬小体为桥梁进入胞质，并将DNA释放到细胞核，使抗原在机体内进行表达而诱导相应的细胞免疫和体液免疫。通过各种方法减毒的沙门氏菌，虽然失去了对动物的致病性，但不影响其在体内的繁殖和侵袭能力。
cya基因是研究非常深入的沙门菌毒力调节基因。cya编码环化腺苷酸合成酶，cya基因的突变株影响参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因表达，并且影响菌毛和鞭毛的表达。cya突变株能在普通培养基上生长。cya缺失后的减毒沙门氏菌消除了细菌在哺乳动物中摄取cAMP的惟一途径，因此在宿主体内不能转化成野生型菌株。
为进一步研究鼠伤寒沙门氏菌毒力基因cya的功能，制备鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失的变异株，根据鼠伤寒沙门氏菌cya基因序列，设计两对PCR特异性引物，扩增并纯化上下游606bp及821片段后，分别连接到pMD18-T载体上，将两组正确的连接产物分别经BamHⅠ和PstⅠ及PstⅠ和HindⅢ双酶切后，将消化后的两片段定向连接到pMD18-T载体上，构建成功基因缺失的同源性核苷酸片段cya—。然后以pMD18-T为模板重新扩增了cya—并再次连接到pMD18-T载体，引入了SalⅠ酶切位点，并将阳性克隆进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收纯化。将该片段连接到经过BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的自杀质粒pKNG101，转化感受态细胞C118λpir。将经链霉素抗性筛选正确的阳性重组质粒导入鼠伤寒沙门氏菌中，进行同源重组。用PCR方法观察重组现象，并对变异株进行测序分析。PCR及测序分析显示，变异株cya基因缺失了2046个碱基。成功构建鼠伤寒沙门氏菌cya毒力基因缺失株。
在基因缺失的过程中发现，由于沙门氏菌普遍的耐药性，使得仅有链霉素抗性基因的自杀质粒pKNG101在转化后的阳性筛选中显得比较麻烦。设计一对特异性引物，以pET—28为模板，扩增了卡那霉素抗性基因1000bp片段，将该片段连接到pMD18-T载体上，经BamHⅠ及ApaⅠ双酶切后与同样经BamHⅠ及ApaⅠ双酶切的自杀质粒pKNG101连接，构建了携带链霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的自杀质粒pKNG201，为阳性克隆的筛选提供了极大的方便。