论文部分内容阅读
微生物燃料电池(Microbial Fuel Cells，MFC)是一种利用微生物来分解代谢各种生物质燃料，将储存在燃料中的化学能直接转化为电能的生物化学催化装置[3]，在生物质转化方面展现了相当大的应用潜能。MFC具有十分广泛的原材料、温和的反应条件、产能效率高、清洁等优势，可广泛应用于污水处理、能源再生、生物传感、生物修复等领域，例如MFC能够在降解有机污染物的同时产生电能，综上所述，MFC在生物质能和环境保护领域中具有突出的应用前景。然而目前，该领域仍处于试验阶段，因此研究MFC电子产生机理、优化微生物产电性能等，对其在各领域中的应用都具有举足轻重的实际指导价值。 铜绿假单胞菌自身可以产生一种具有电子传递作用的特殊的介体——绿脓素，绿脓素能够有效承载微生物体内产生的电子从细胞中传递到电子受体，即阳极上进而产生电流，因此，将铜绿假单胞菌应用于微生物燃料电池上会有更加优良的电化学效率。本论文选用铜绿假单胞菌为研究对象，考察了在其体内过表达NAD合成酶基因nadE对NAD+/NADH水平的影响，进而探究对其产电性能的影响。论文取得了一些创新性的研究成果，如下所示: 1.通过PCR的方法从E.coli DH5α基因组中扩增得到nadE基因片段，将nadE连接到载体pBBR1MCS-5上，构建了表达载体pBBR1MCS-5-nadE，并将其转入Pseudomonasaeruginosa PAO1，得到重组菌，即Pseudomonas aeruginosa-nadE。选择常规的诱导条件:1 mmol/L IPTG诱导剂浓度，37℃，200rpm诱导10h，测定上述重组菌和原始菌中NAD合成酶的比酶活。结果表明，测定的原始菌NAD合成酶的比酶活为2.72 U/g，而重组菌NAD合成酶的比酶活为5.37 U/g，是原始菌的1.97倍。 2.选取诱导OD值、诱导时间和诱导剂浓度为影响因素，利用响应曲面法进行中心复合试验对重组菌株诱导表达nadE基因的条件进行优化。中心复合实验结果显示在30℃生长条件下，OD值为0.43、诱导时间为10.3 h、诱导剂IPTG浓度为0.69 mM时，NAD合成酶的比酶活为8.21 U/g，比酶活比原始菌提高了3倍左右。 在优化的诱导条件下，结合重组菌的生长曲线和NAD合成酶的比酶活变化曲线，在既要维持NAD合成酶比酶活相对较高（培养7h后），又要满足菌体更好更快地富集于阳极膜的时机（培养6-8 h）的情况下，我们确定了培养和接入电池的条件:诱导OD为0.43、诱导剂IPTG浓度为0.69mM、诱导时间为6h（即培养约7-8 h），此时将菌液接入电池比较利于本论文中所研究的微生物燃料电池的顺利运行。 3.通过测定电池电压曲线、极化曲线、功率密度曲线、循环伏安图等性能进一步考察和比较了重组菌和原始菌的电化学性能差异。结果显示，当电池运行稳定后，接种原始菌铜绿假单胞菌PAO1的微生物燃料电池稳定后的最高输出电压为250 mV左右，功率密度为89.29 mW/m2，而接种重组菌P.aeruginosa-nadE的微生物燃料电池稳定后的最高输出电压为590 mV左右，功率密度为497.29 mW/m2，分别是原始菌株P.aeruginosaPAO1的2.36倍和5.57倍。由极化曲线和功率密度曲线计算的重组菌的电池内阻为712.86Ω，而原始菌株的内阻为1597.14Ω，说明重组菌株比原始菌株更利于减小微生物燃料电池的内阻;循环伏安图可以推断重组菌株中绿脓素这种氧化还原介体产生的程度几乎是PAO1的两倍左右。 4.利用HPLC测定了铜绿假单胞菌胞内绿脓素的含量，结果显示原始菌在MFC中产生的绿脓素为0.87μg/ml，而重组菌为2.39μg/ml，为原始菌PAO1的2.75倍，说明NAD合成酶的过量表达有利于绿脓素的合成。同时利用酶循环法测定了菌体内NAD+和NADH的含量，结果显示，NAD合成酶的过量表达一方面可以有效的提高重组菌细胞内的NAD+及NADH的含量，提高了菌体的产电子能力;另一方面NAD+/NADH的改变引起菌体内代谢水平改变，使绿脓素产量增多，提高了菌体的电子传递效率，从而提高铜绿假单胞的产电能力。