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羧酸酯酶家族7的乙酰木聚糖酯酶是一类具有双重功能的酶,它既可以水解脱去低聚木糖侧链上的酰基,又可以水解头孢菌素C侧链上的酰基。因此,乙酰木聚糖酯酶具有双重应用价值。一方面,乙酰木聚糖酯酶在半纤维素木聚糖的降解中起重要作用。该酶与木聚糖降解酶系的其他酶系一起,水解具有复杂结构的半纤维素木聚糖,使得开发和利用自然界中取之不尽的可再生资源成为可能,近些年获取高活力的乙酰基木聚糖酯酶及解析此酶的结构和功能已经成为研究的热点。另一方面,乙酰木聚糖酯酶脱去7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和CPC的酰基,合成β-内酰胺类抗生素母核,可应用于β-内酰胺类抗生素的工业生产。 本研究一种枯草芽胞杆菌为研究对象,开展了以下研究内容,并获得了丰富的研究成果,具体内容如下: (1)一种枯草芽胞杆菌乙酰木聚糖酯酶被鉴定,测定其pNPA酶活力为0.62U/mL;探讨了诱导剂对乙酰木聚糖酯酶活力的影响,发现小分子诱导剂如乙酸乙酯、木糖对酶的诱导作用十分显著,大分子诱导剂则不明显,另外,在不添加诱导剂的情况,乙酰木聚糖酯酶仍有一定的表达量。 (2)枯草芽胞杆菌中的乙酰木聚糖酯酶基因(GenBank no.KC292495)被克隆出来。合成的乙酰木聚糖酯酶基因由318个氨基酸编码构成,长度为957 bp,单体分子量为35607.19 Da,本研究乙酰木聚糖酯酶与解淀粉芽孢杆菌FZB42和枯草芽胞杆菌亚种168的乙酰木聚糖酯酶同源性很高,属于羧酸酯酶家族7。 (3)乙酰木聚糖酯酶在大肠杆菌中得到高效过表达,经凝胶过滤纯化后的纯酶pNPA活力达到2949 U/mg,对CPC、7-ACA的活力分别达到484 U/mg、888 U/mg,均为羧酸酯酶家族7的已报道的乙酰木聚糖酯酶中的最高酶活力。 (4) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,乙酰木聚糖酯酶的单体分子量为36 kDa,凝胶过滤结果显示天然状态下乙酰木聚糖酯酶分子量为223 kDa,即天然状态下,乙酰木聚糖酯酶为同源六聚体。然而,本研究发现乙酰木聚糖酯酶六聚体在1%SDS溶液中可以解聚为三聚体,测得三聚体的分子量为107 kDa。并且,在除去SDS后,三聚体很可能自动重新聚合为六聚体;1%SDS处理后的三聚体的活性为六聚体活性的33%。 (5)本研究考察了重组乙酰木聚糖酯酶的酶学性质,发现乙酰木聚糖酯酶对链长超过4的脂肪酸酯无活力;乙酰木聚糖酯酶最适反应温度为50℃,最适pH为8.0;非常好的温度的稳定性和广泛的pH耐受性;极强的有机溶剂耐受性。 由于重组乙酰木聚糖酯酶特殊的多聚体形式,此酶在蛋白重折叠和SDS的作用机理方面有很高的科研价值;由于乙酰木聚糖酯酶的高酶活力和高稳定性,乙酰木聚糖酯酶在木聚糖的降解,尤其是β-内酰胺类抗生素的工业生产中有重要的研究和应用价值。