【摘 要】
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研究背景:抑癌基因PTEN（phosphatase and tension homologue deleted from chromosome 10）是位于人类第十号常染色体的基因,其表达的产物属于蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine
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研究背景:抑癌基因PTEN（phosphatase and tension homologue deleted from chromosome 10）是位于人类第十号常染色体的基因,其表达的产物属于蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases,PTP）家族,并且不同种属的PTEN基因具有高度同源性。PTEN基因是多种生物体内重要的调控因子,可参与多种细胞的增殖、分化和凋亡等环节[2]。另外最新的科学研究证据表明,PTEN基因在中枢神经系统神经元的生长分化、轴突的修复和突触可塑性等方面发挥着重要的调控作用,参与多种神经退行性疾病发病机制的重要环节。早有研究指出PTEN尤其与黑质-纹状体的多巴胺神经递质[10,11]、α-突触核蛋白毒性[12]、线粒体功能障碍[13]等机制均有关联,这为帕金森疾病发病机制、潜在基因诊断位点以及治疗靶点等方面提供了新的思路。故本研究选择构建PTEN基因多种重组质粒并纯化融合蛋白,为后续进一步研究PTEN基因序列特性、蛋白的结构生物学功能以及在PD发病机制中的研究和进一步开展临床检测创造出有利的条件。研究目的:1.根据从基因库中查询到的PTEN基因序列以及细胞类型的不同设计相应的引物,是后续实验最基础的一步。2.利用基因重组技术构建PTEN的真核重组质粒pCDNA 3.1-FLAG-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应以及点突变实验提供了分子学基础物质。3.真核重组质粒pCDNA 3.1-FLAG-PTEN转染到HEK 293细胞后验证其能正常表达,为今后进一步研究PTEN基因对PD模型细胞的生物学影响以及用于PD基因诊疗提供科学的实验依据。4.原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN转化到大肠埃希菌BL-21中诱导其正确表达出相应的PTEN重组蛋白,并提取纯化融合蛋白,为后续研究PTEN蛋白的磷酸化位点以及降解方式等多种生物学功能以及与PD相关信号通路之间的联系奠定了实验基础。研究方法:根据GeneBank中查询到的PTEN基因序列,设计并合成相应的引物,验证成功后再用基因重组技术将目的片段插入到pCDNA 3.1-FLAG和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA 3.1-FLAG-PTEN转染到HEK 293细胞、pGEX-6P-1-GST-PTEN转到大肠埃希菌BL-21中,通过蛋和白印迹技术考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。研究结果:1.PCR显示目的基因插入成功,DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变。2.原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN构建成功。3.真核重组质粒pCDNA 3.1-FLAG-PTEN构建成功。4.应用蛋白印迹技术和考马斯亮蓝染色法证实原核、真核融合质粒可以在相应类别的生物体内正确表达。研究结论:成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为进一步进行研究PTEN在PD中的具体分子机制及作用效应研究奠定了基础。
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