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目的:观察马钱子碱及马钱子碱纳米微粒对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用,初步揭示该药物抗肝癌的作用机制,为肝癌治疗提供新的方法和理论依据。
方法：
(1)体外抗肿瘤实验:体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,提取马钱子药物血清,MTT法测定马钱子药物血清(5％、10％、20％浓度)对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制作用。采取MTT法观察不同浓度马钱子碱(10、20、40、80、160、240、320、400μg/ml)对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用,测定抑制率及IC50。
(2)马钱子碱对人肝癌细胞增殖和凋亡相关因子表达的影响:常规培养人肝癌SMMC-7721细胞,加入马钱子碱(320μg/m1),作用0hr、36hr、72hr后,分别收集细胞,提取总蛋白和总RNA,采用Western blotting和荧光定量PCR方法检测Fas、CyclinD1、PCNA蛋白和mRNA的表达变化。
(3)马钱子碱纳米微粒对人肝癌细胞凋亡相关因子Fas表达的影响:常规培养人肝癌细胞,分别加入马钱子碱纳米粒和同等剂量空白纳米粒,分别构成含:160μg/ml同等剂量空白纳米粒对照组、160μg/ml马钱子碱纳米粒、320μg/ml同等剂量空白纳米粒对照组、320μg/ml马钱子碱纳米粒的培养体系,培养72小时后,收集细胞,提取总蛋白和总RNA,采用Westernblotting和荧光定量PCR方法检测人肝癌细胞凋亡相关因子Fas表达变化。
结果：
(1)马钱子及马钱子碱对人肝癌SMMC-7721细胞的生长具有明显的抑制作用,其抑制效应与马钱子药物血清浓度及马钱子碱剂量成正相关,20％马钱子药物血清对人肝癌细胞72小时的生长抑制率为54.935±8.191％,与5％、10％浓度相比存在统计学差异(P＜0.05)。马钱子碱作用人肝癌细胞72小时的IC50为206.56μg/ml。马钱子碱剂量为320μg/ml时,对肝癌细胞生长抑制率接近100％,并可见大部分细胞失去正常细胞结构,细胞皱缩,胞质内见“空泡”现象,细胞核凝聚、碎裂。
(2)马钱子碱促使Fas的蛋白和mRNA表达上调,药物作用72hr,Fas mRNA相对表达为0.0139±0.001,蛋白相对表达为1.395±0.101,与对照组比较,差别具有统计学意义(P＜0.05),而PCNA和Cyclin D1蛋白和mRNA表达变化无统计学意义(P＞0.05)。
(3)马钱子碱纳米粒相对于空白纳米粒作用于人肝癌细胞72hr后,出现明显的肝癌细胞凋亡,不同剂量的马钱子碱纳米粒均能促使Fas蛋白和mRNA的表达上调,而不同剂量的空白纳米粒作用于肝癌细胞后,Fas蛋白与mRNA表达变化无统计学差异(P＞0.05)。
结论：
1.马钱子具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长的作用
2.马钱子碱能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长,抑制作用存在剂量依赖性
3.马钱子碱能够诱导肝癌细胞凋亡,从而抑制肝癌细胞生长
4.马钱子碱及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡,可能与上调人肝癌细胞Fas蛋白和mRNA表达有关,随马钱子碱剂量增加而表达量增加
5.马钱子碱纳米粒是一种具有潜在发展前景的肝癌治疗药物