论文部分内容阅读
极端微生物的研究自20世纪70年代以来引起全世界的广泛关注，已成为当今研究热点，它们在极端环境长期适应过程中形成了独特的性质。对它们的研究不仅对了解生命的极限、进化与分类等很有理论价值，而且对环境污染、生态、微生物新功能等具有重要的实际意义。南极冰藻是极地海洋生态系统中重要的初级生产者，在南极海洋生态系统中具有重要的地位和作用。
谷胱甘肽系统在清除活性氧和生物保护中发挥重要作用，谷胱甘肽(GSH)是抗坏血酸-谷胱甘肽循环的重要组成成分，在维持胞内氧化还原水平具有不可缺少的作用；谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)催化H2O2和脂质过氧化氢的还原，保护细胞免受氧化伤害；谷胱甘肽硫转移酶(GST)催化谷胱甘肽与各种有毒的亲电化合物发生结合起到解毒作用；谷胱甘肽还原酶(GR)是维持谷胱甘肽库处于较高还原水平的关键酶。南极生物存在的环境特殊，温度低、干燥、高盐度、强辐射、随季节极度变化的光照强度，以及海水中较高浓度的溶解氧，使得自由基的产生非常容易，近年来对其研究越来越多，它们应该具有更有效的机制来清除活性氧。本研究拟探讨南极冰藻胞内谷胱甘肽含量；并以硅藻GJ01为材料研究影响谷胱甘肽水平的因素、进一步优化条件提高其产谷胱甘肽的能力；以南极衣藻ICE-L为材料从谷胱甘肽及其相关酶的角度，进一步阐明南极冰藻的适应机制(包括低温和重金属)，对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶进行分离纯化，得到均一产品，详细阐明该酶的性质。该项研究不仅能为谷胱甘肽新来源的获得提供科学依据，而且能进一步完善南极冰藻对胁迫的适应机制，为抗逆性品种改良等方面提供新的思路。
(1)用分光光度法对24种已鉴定或初步鉴定的南极冰藻，胞内谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成能力(GPA)、谷胱甘肽还原酶活力等进行测定。测定结果表明南极蓝藻B-1中谷胱甘肽含量最高；南极衣藻ICE-L和南极硅藻GJ01的谷胱甘肽总产量居前2位；南极冰藻的谷胱甘肽合成能力普遍高于常温绿藻的，仅2种冰藻谷胱甘肽合成能力低于三角褐指藻的。南极硅藻GJ01和南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶活力高于对照组的。培养基的选择表明，f/2培养基适合南极硅藻GJ01的生长，而Provasoli培养基适合南极衣藻ICE-L的生长。鉴于南极硅藻GJ01和南极衣藻ICE-L的谷胱甘肽总产量和谷胱甘肽合成能力等，高于对照组和其他南极冰藻的，故选取这两种南极冰藻作进一步深入研究。可见，南极冰藻成为谷胱甘肽的新来源是有可能的。
(2)以南极硅藻GJ01为对象，探讨它的生长规律、胞内谷胱甘肽含量随时间的变化规律、不同培养基补加方式对谷胱甘肽含量的影响，同时也测定其谷胱甘肽合成能力和谷胱甘肽还原酶活力的变化。结果表明，南极硅藻GJ01的生长对数期在6-10d之间，完整的生长周期在14d以上；谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成能力、谷胱甘肽还原酶活力随生长时间而发生周期性变化，对数期后期和稳定期初期是收获谷胱甘肽的最佳时机。9d前保持较高的谷胱甘肽合成能力和谷胱甘肽含量；3d左右谷胱甘肽还原酶的活力最高。
当培养物培养6天到8天后，每2d加入一定量的新鲜培养液，可以达到谷胱甘肽较高的得率，提高了谷胱甘肽合成能力，也增加了蛋白质的合成。但是谷胱甘肽还原酶的变化规律不明显。可见细胞中谷胱甘肽含量不仅与生长时间有关，而且还与培养方式等有关。这些规律的认识对冰藻的实际应用具有指导意义。(3)以南极硅藻GJ01为材料，测定营养条件和谷胱甘肽的前体氨基酸等因子对硅藻GJ01生长和产谷胱甘肽的影响，并对硅藻GJ01细胞和非细胞酶耦联硅藻GJ01ATP再生系统，合成谷胱甘肽的条件分别进行优化。结果表明，在单因子影响条件下，1.2g/L的碳酸氢钠对南极硅藻GJ01的生长最好，且最有利于谷胱甘肽的积累；800μmol/L氯化钙对GJ01的生长最为有利，而200μmol/L氯化钙对谷胱甘肽的产生是适宜的；维生素B12和生物素对GJ01谷胱甘肽的产生影响较小；硅藻GJ01谷胱甘肽合成系统酶的最适温度为10-25℃，最适pH为7.0；Glu、Cys、Gly的最适浓度分别为24mmol/L、12mmol/L、8mmol/L，此外Met对谷胱甘肽的合成也有影响；硅藻GJ01的谷胱甘肽合成能力是Mg2+依赖性的，其最适浓度在10-20mmol/L之间。正交试验表明，硅藻GJ01细胞产生谷胱甘肽的最优条件为，光照为16h光/8h暗，NaHCO3为1.6g/L，Ca2+为0.4mmol/L，Cys为10mmol/L；硅藻GJ01游离谷胱甘肽合成酶系和完整细胞ATP再生系统耦联，产生谷胱甘肽的最理想条件为，温度30℃、Cys为10mmol/L、Mg2+为30mmol/L、pH为7.5。
(4)以南极衣藻ICE-L为材料，对其在不同温度条件下谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽还原酶活力、以及谷胱甘肽和蛋白质含量进行测定，以阐明谷胱甘肽系统在低温适应中的作用。结果表明，谷胱甘肽系统在南极衣藻ICE-L低温适应过程中，谷胱甘肽、谷胱甘肽硫转移酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶与低温适应呈正相关，随着温度的降低，谷胱甘肽含量增加，这三种酶的活力都提高；同时除谷胱甘肽还原酶外其他因子与南极衣藻ICE-L高温适应呈负相关，温度高于最适温度时谷胱甘肽还原酶活力增加，谷胱甘肽含量下降，谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力降低，蛋白质随温度变化规律不明显。可见谷胱甘肽及其相关酶在南极衣藻ICE-L低温适应过程中具有重要作用，这是对低温适应的保护机制之一，能够有效地清除活性氧，保护细胞免受伤害。
(5)随着人类活动的加强，Cd极有可能出现在南极，它是一种毒性强且非常普遍的重金属污染物。本文研究Cd对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽水平及其相关代谢酶的影响，以阐明南极冰藻的谷胱甘肽系统在其重金属适应中的作用。Cd能引起衣藻ICE-L生长速度减慢、丙二醛含量增加，谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽硫转移酶活力得到提高，可见谷胱甘肽系统在抗重金属胁迫中也具有作用。超微结构表明，当Cd浓度增加至160μmol/L时，淀粉颗粒和类囊体片层的破坏加重，空泡化明显，且原生质体发生收缩，膜变形，细胞壁变得不清且出现缺痕，这种变化对生长代谢可以造成明显的影响。这些参数可以用来反映Cd或其他重金属污染对南极生物圈的生物学影响。
(6)以硫酸铵沉淀、离子交换、亲和层析和凝胶过滤等方法，对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶进行分离纯化。结果表明，南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶纯化物总蛋白为0.05mg，总纯化倍数达12771.4倍，总回收率为25.1％，酶的比活力为178.8000U/mg，电泳表明达到均一性。谷胱甘肽还原酶亚基的表观分子量为54.6kDa，与已知的谷胱甘肽还原酶的大小是非常相似的。谷胱甘肽还原酶对NADPH的表观米氏常数Km~DPH为23.3μmol/L、对GSSG的表观米氏常数KmGSSG为66.0μmol/L、对NADH的表观米氏常数KmNADH为83.8μmol/L。其中KmNADPH比许多已知酶的要大，且能够以NADH为底物，这在谷胱甘肽还原酶中是不多见的。
(7)在对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶分离纯化的基础上，对其性质进行系统的测定，包括pH、温度、缓冲液、离子强度、无机离子、螯合剂、酶保护剂等对该酶的影响。结果表明，该谷胱甘肽还原酶的最适pH为7.5，强碱性对其活性影响比较大。最适温度为25℃，对高温具有不稳定性，活化能为3.7kJ/(mol·K)，-78℃保藏是最佳的保藏方法。最适缓冲液是50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，最适离子强度为90mmol/L，最适Mg2+为7.5mmol/L。
(NH4)2SO4(1mmol/L)、Ca2+、Mg2+以及与谷胱甘肽有关的巯基化合物和ATP等，对谷胱甘肽还原酶有促进作用；螯合剂不同程度地抑制谷胱甘肽还原酶的活力，其中EGTA作用最强；重金属离子如Cd2+、pb2+、Cu2+、Zn2+等对谷胱甘肽还原酶的抑制率达100％；表面活性剂、酶保护剂、NEM、NADPH和ADP对谷胱甘肽还原酶均具有抑制作用。表明南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶是低温酶。综上所述，南极冰藻中谷胱甘肽含量较高，并且通过条件优化，使南极硅藻GJ01在谷胱甘肽生产上的实际应用成为可能。南极冰藻在长期进化过程中已形成了相应的适应机制，谷胱甘肽系统在对抗低温和Cd的胁迫中具有重要作用，谷胱甘肽含量增加和酶活力提高有利于及时清除活性氧和解毒。南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶的分离纯化，表明它与其他来源的谷胱甘肽还原酶具有异同点，且具有低温酶的特性，这对谷胱甘肽还原酶资源和低温酶适应机制等方面的研究具有重要意义。