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马尾松花粉多糖与细胞发生作用是在细胞外还是细胞内尚且未知,前期本实验室对马尾松花粉多糖进行荧光标记后发现多糖能够进入细胞。用细胞表面受体TLR4抑制剂处理后能够显著抑制多糖进入细胞,说明多糖可能通过细胞表面受体发挥功效,荧光标记多糖提供了示踪多糖的技术基础。实验室研究还表明硫酸酯化的马尾松花粉多糖较未酯化的多糖具有更多的功能,但硫酸酯化的马尾松花粉多糖到底是在细胞内还是通过细胞表面受体发挥作用尚不清楚。因此本实验将马尾松花粉多糖同时进行硫酸酯化与荧光标记,探究多糖与细胞表面受体的作用。本文的主要内容如下:一、对马尾松花粉多糖进行提取、纯化及检测。采用热水浸提法提取马尾松花粉多糖,三氯乙酸法除蛋白后乙醇分级沉淀获得60%乙醇沉淀的多糖,命名为PPM60,然后用中压制备色谱技术进行分离纯化,共分离出五个多糖峰,对每个多糖峰进行纯度检测最终选用纯度较好的峰III,命名为PPM60-III。二、对PPM60-III进行硫酸酯化与荧光标记。采用氯磺酸-吡啶法对PPM60-III进行硫酸酯化,硫酸根取代度为1.21,将硫酸成功酯化后的多糖命名为SPPM60-III;然后采用酪胺还原法对SPPM60-III进行荧光标记,荧光取代度为0.43%;将其命名为FSPPM60-III;红外光谱仪和荧光光谱仪检测结果显示成功对PPM60-III进行了硫酸酯化和荧光标记;对FSPPM60-III进行了多糖含量的测定,测得多糖含量为71.74%;同时用FDSS(FITC-dextran sulfate sodium)作对照。三、探究FSPPM60-III对RAW264.7细胞活性、吞噬和迁移能力的影响。结果显示FSPPM60-III和FDSS都在浓度为200?g/mL时显著促进细胞增殖,后续实验综合选用多糖作用浓度为200?g/m L;PPM60-III和FSPPM60-III能显著促进细胞吞噬作用;FSPPM60-III能显著促进细胞贴壁,PPM60-III、FDSS和FSPPM60-III对细胞迁移能力都没有显著影响;四、探究巨噬细胞表面三种受体TLR4、TLR2和Dectin-1与多糖的作用。CLSM结果表明三种受体与FSPPM60-III和FDSS都存在共定位现象;用三种受体的抑制剂作用细胞后再加入多糖进行FCM检测,结果表明三种受体抑制剂都能显著抑制多糖进入细胞;说明多糖可能与三种受体发生作用。五、探究了三种受体对RAW264.7胞内钙离子和细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的影响。结果表明FSPPM60-III和FDSS与细胞作用后引起胞内钙离子浓度的升高与巨噬细胞表面的受体TLR4、TLR2和Dectin-1受体有关;三种受体抑制剂也都能或者部分显著性抑制多糖引起的细胞分泌细胞因子的增加;结果再次表明FSPPM60-III和FDSS通过与巨噬细胞表面的三种受体发挥作用。结论:FSPPM60-III能显著性促进细胞增殖、细胞贴壁和细胞吞噬能力提高了机体免疫调节能力;FSPPM60-III与细胞表面受体存在共定位现象,加入受体抑制剂后能显著性抑制多糖进入细胞,且加入受体抑制剂后能显著性抑制FSPPM60-III诱导产生的胞内钙离子及细胞因子的增加,说明细胞表面受体TLR4、TLR2和Dectin-1是FSPPM60-III的作用靶点,除三种受体外FSPPM60-III还可能与细胞表面其他受体结合发挥多糖功效。