【摘 要】
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基于间充质干细胞（MSCs）和内皮细胞（ECs）体外共培养构建预血管化骨组织是解决传统骨组织工程中传质限制问题最直接、有效的方法之一。然而在成骨诱导环境中,共培养的ECs存在增殖能力差、存活率低以及血管样网络形成能力差等问题,因此亟需探究共培养体系中影响ECs成血管的因素及作用机制。此外,流体剪切力（FSS）是调控体内骨形成和骨重塑的重要因素,为更好地通过模拟体内力学微环境构建预血管化骨组织,有必
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基于间充质干细胞（MSCs）和内皮细胞（ECs）体外共培养构建预血管化骨组织是解决传统骨组织工程中传质限制问题最直接、有效的方法之一。然而在成骨诱导环境中,共培养的ECs存在增殖能力差、存活率低以及血管样网络形成能力差等问题,因此亟需探究共培养体系中影响ECs成血管的因素及作用机制。此外,流体剪切力（FSS）是调控体内骨形成和骨重塑的重要因素,为更好地通过模拟体内力学微环境构建预血管化骨组织,有必要将FSS应用于MSCs和ECs共培养体系并探究其对共培养物成骨的影响与作用机制。基于此,本研究首先考察共培养体系中成骨诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）成血管的影响与调控机制;其次,探究循环振荡FSS对共培养中细胞生理特性的影响,深入认识FSS与共培养体系协同调控BMSCs成骨分化的作用机制。研究结果显示,全骨髓贴壁法分离的BMSCs从形态、表面抗原表达以及三向分化能力方面均符合MSCs的基本特性;静态成骨诱导环境中,BMSCs与HUVECs共培养提高BMSCs的ALP活性、钙沉积以及成骨标志基因ALP、Runx2、COLI和OCN表达,然而HUVECs血管样网络形成受到显著抑制;进一步发现成骨诱导的BMSCs通过p38-p53途径高表达TSP-1,TSP-1导致HUVECs的增殖和成血管关键蛋白KDR、AKT、ERK1/2以及eNOS的磷酸化水平下降,凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase-3的活化水平上升;通过下调BMSCs中TSP-1表达有助于共培养物成血管能力的恢复。采用前期实验室建立的2 h/d的FSS施加条件,研究发现FSS通过加速BMSCs-HUVECs共培养物由G0/G1期转变为S期的细胞周期进程,显著促进共培养物的细胞增殖,但对单培养的BMSCs、HUVECs的增殖无明显作用;FSS有助于成骨诱导环境下共培养的HUVECs的细胞活性维持;此外,2 h/d的FSS作用进一步增强共培养的BMSCs的ALP活性和钙沉积,显著提高BMSCs中成骨标志物ALP、Runx2、COLI和OCN的mRNA水平和OPN、OCN的蛋白水平;深入探究发现,FSS促进共培养的HUVECs表达TGF-β,协同共培养上调BMSCs中Integrin β1表达,激活胞内FAK-ERK1/2信号通路,进而上调Runx2的表达,从而增强共培养的BMSCs成骨分化。上述研究结果为提高基于MSCs和ECs共培养为基础的预血管化骨组织构建过程中成血管和成骨分化提供理论基础和指导意义,为工程化骨组织临床转化奠定基础。
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