论文部分内容阅读
背景和目的： 近年来我国前列腺癌(Prostate cancer, PCa)患者人数明显增多，相当数量患者在确诊时已处于进展期。雄激素剥夺是治疗进展期PCa的重要手段，但PCa患者在雄激素剥夺内分泌治疗的同时几乎不可避免地发展为去势抵抗性前列腺癌（Castration resistant prostate cancer, CRPC), CRPC容易获得性耐药，预后差。基础和临床证实仅围绕雄激素受体信号通路（Androgen receptor signaling pathways, ARSPs)治疗CRPC远远不够，而针对非雄激素受体信号通路(Non-androgen receptor signaling pathways, NARSPs)的药物可能发挥重要的治疗作用。其中PI3K-Akt-mT0R通路与CRPC的发生、发展和耐药密切相关。虽mTOR信号通路抑制剂-依维莫司副作用相对较小，但在CRPC患者临床试验中疗效不太满意，如何提髙其疗效减少其耐药值得研究。我们课题组先前所关注的一个抑癌候选基因-氮通透酶调节样物2(NPRL2)可能参与mTOR信号通路，而该信号通路被证实参与细胞自噬，一种进化保守能形成双层脂质囊形装置能回收再利用胞浆“废物”有助于维持细胞在如缺氧、营养饥饿、放化疗等恶劣微环境下的存活和生长。故本课题提出NPRL2-依维莫司耐药-自噬在CRPC中可能存在一定联系的科学假设。但截止目前，有关NPRL2在前列腺癌（包括CRPC)中尚进一步分析其在依维莫司耐药中的作用及部分可能的机制。 方法： 1.收集良性前列腺增生(BPH)、非CRCP前列腺癌(PCa)和 CRPC患者术后的临床标本行NPRL2免疫组织化学法染色，观察NPRL2在BPH、PCa和CRPC中的表达差异。评估NPRL2表达与患者年龄、PSA、T分期以及Gleason分组分级，是否转移等临床病理参数之间的相关性;对NPRL2的表达与部分患者术后生存时间作Kaplan-Meier分析，对上述临床病理参数行Cox风险比例回归分析以评价NPRL2的预后作用。 2.检测正常的永生化前列腺上皮细胞RWPE-1，前列腺癌细胞：LNCaP、模拟去势抵抗性前列腺癌的耐恩杂鲁胺的LNCaP细胞(LNCaP for Enzalutamide-resistant cell,简称LNPER细胞）以及非雄激素依赖的PC3细胞中NPRL2的表达情况。针对LNCaP、LNPER和PC3细胞，利用慢病毒转染沉默/过表达细胞NPRL2，进一步采用CCK-8法检测细胞生长和增殖，流式细胞术观察LNPER和PC3细胞的凋亡情况。 3. Western blot检测LNPER和过表达/沉默NPRL2的LNPER细胞以及PC3和过表达/沉默NPRL2的PC3细胞中mTORCl信号通路中的重要效应蛋白包括mTOR、p-mTOR以及p70S6K(S6K)、p-S6K的表达情况。 4.进一步探讨NPRL2对 LNPER和PC3细胞自噬的影响，评估不同依维莫司浓度下LNPER和PC3细胞的存活率。另一方面，采用自噬抑制剂氯喹干预PC3和LNPER的自噬，检测细胞存活率和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及PARP蛋白的表达情况。 5.最后构建裸鼠成瘤模型观察依维莫司对瘤体生长的影响以及自噬相关蛋白LC3-II/I、p62和凋亡蛋白Bcl-2、Bax以及PARP的表达情况。 结果： 1.本研究不同于以往NPRL2作为以抑癌候选基因在多种肿瘤如肺癌、肾癌、胶质瘤、乳腺癌、结肠癌中低表达而相应正常组织中高表达的现象。本研究发现NPRL2在BPH呈现低表达，PCa和 CRPC组织中NPRL2表达较为丰富。NPRL2的表达与PCa患者高Gleason分级分组，髙病理分期（pT stage)以及淋巴结转移呈正相关。在一定程度上，髙表达NPRL2的PCa患者预后更差，生存期短于低表达的患者，但对于pT3及以上患者NPRL2的表达与预后无明显差异。 2.细胞实验发现RWPE-1细胞中N PRL2蛋白水平较低，而LNCaP、LNPER和PC3细胞NPRL2表达丰富。过表达NPRL2能明显增加LNCaP、LNPER和PC3细胞的生长，而沉默NPRL2能减少上述细胞的生长。另外，沉默NPRL2能轻度增加PC3和LNPER细胞凋亡率。 3. NPRL2能影响CRPC的mTOR信号通路：沉默NPRL2能上调LNPER和PC3细胞的p-mTOR和p-S6K的表达，反之则下调p-mTOR和p-S6K的表达。 4.过表达NPRL2能促进PC3和LNPER细胞自噬，而沉默NPRL2则减少这两种细胞的自噬，沉默NPRL2、自噬抑制剂均能增加依维莫司处理下的细胞凋亡；而过表达NPRL2能明显减少依维莫司对PC3和LNPER的细胞毒性。 5.依维莫司能显著抑制沉默NPRL2后的LNPER细胞的裸鼠皮下瘤体的生长，Western blot检测显示出沉默NPRL2后的LNPER细胞皮下瘤体呈现出自噬减少、凋亡增加的现象。 结论： NPRL2的表达一定程度上与PCa的不良预后呈负相关，PCa和CRPC中的NPRL2可能作为一促生长因子存在，而非抑癌基因身份。NPRL2能增加CRPC自噬和依维莫司相对耐药。靶向抑制NPRL2或抑制自噬能增加依维莫司对CRPC的疗效。