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肌球蛋白(myosin)是一类能结合肌动蛋白(actin)并能够把ATP水解产生的化学能转化为机械能的分子马达，包括典型肌球蛋白(又称第二类肌球蛋白，myosin-2)和种类繁多的非典型肌球蛋白。脊椎动物的典型肌球蛋白包括三亚类:横纹肌肌球蛋白(Striated muscle myosin)、平滑肌肌球蛋白(Smooth muscle myosin，SmM)和非肌肉肌球蛋白2(Non-muscle myosin-2，NM2)，其中NM2包括三种亚型:NM2A，NM2B和NM2C。 SmM和NM2有相似的结构和调节机制，SmM和NM2都由2条重链，2条必需轻链(Essential light chain，ELC)和2条调节轻链(Regulatory light chain，RLC)组成。重链N端～700氨基酸残基构成马达区域(Motor domain)，之后是ELC和RLC结合的IQ模序(IQ motif)，2条重链C端～1000氨基酸残基形成coiled-coil结构，构成二聚体。典型肌球蛋白的coiled-coil区域包括2部分，亚马达区域(Subdomain2，S2)和轻酶解肌球蛋白(Light meromyosin，LMM)，通过LMM的相互作用典型肌球蛋白可以聚合成纤维结构。肌球蛋白的马达活性必须受到精确的调控以确保其功能的正常行使同时避免能量的浪费。SmM和NM2马达活性受RLC的第19位丝氨酸磷酸化调节。SmM和NM2的功能已研究多年，但其结构与功能的关系以及磷酸化调节的分子机制仍有待深入研究。 首先，我们对SmM头尾相互作用在磷酸化调节中的功能进行了研究。非磷酸化状态下，SmM的头部和S2相互作用，LMM折叠形成两个片段，进一步与头部和S2相互作用，形成稳定的自我抑制折叠构象。磷酸化破坏了上述相互作用，使SmM形成高活性的伸展构象。然而，维持自我抑制折叠构象的分子机制并不清楚。 前人的结构分析表明S2保守酸性氨基酸E911-E914和E932分别与头部碱性氨基酸R530和loop2碱性氨基酸区域存在相互作用。我们的突变分析和酶活性测定表明E911-E914参与维持折叠抑制状态，而E932和R530可能不参与头尾相互作用。 为了研究LMM在维持折叠构象中的作用，我们构建了一系列尾部长度不同的SmM的截短片段，通过构象和活性分析，发现尾部LMM的1535-1591区域对于维持折叠构象非常重要。此外，我们还鉴定了C端的32氨基酸对于SmM纤维的形成非常重要，暗示着纤维的形成可能是从尾部的尖端开始。 其次，我们分析比较了典型肌球蛋白特异性的小分子抑制剂blebbistatin对SmM和三种NM2亚型(NM2A，NM2B和NM2C)的抑制。NM2A和NM2B受到小分子抑制剂blebbistatin的抑制，但是对于在结构和活性调节上与NM2A和NM2B高度同源的SmM是否受blebbistatin明显的抑制还存在着争议，而且也没有blebbistatin对NM2C的抑制情况的报道。为了澄清这些争议，我们利用昆虫细胞Sf9表达SmM和NM2，并且分析了它们对于blebbistatin的敏感性。我们发现blebbistatin明显抑制SmM和NM2C的ATP酶活性，IC50分别为6.47μM(SmM)，3.58μM(NM2A)，2.30μM(NM2B)和1.57μM(NM2C)。这些结果都证明了blebbistatin是SmM和三种NM2亚型的抑制剂。 第三，我们鉴定了一种对blebbistatin抗性的NM2突变，并通过基因编辑技术构建了表达blebbistatin抗性的NM2细胞系。Blebbistatin是NM2三种亚型的有效抑制剂，被广泛用于研究NM2的生物学功能。由于绝大多数哺乳动物细胞都表达一种以上的NM2亚型，因此无法通过使用blebbistatin确定NM2亚型的功能。为了解决这个问题，我们尝试构建不受blebbistatin抑制且功能正常的NM2突变体。通过对结合blebbistatin的NM2的结构和序列分析，确定了参与blebbistatin结合关键氨基酸残基。突变分析和功能实验发现，SmM和NM2的A456F突变体几乎不受blebbistatin抑制，并具有正常的ATP水解活性和体外运动活性。对A456的进一步突变分析表明，在456位上引入大的氨基酸侧链可以抑制blebbistatin与马达头部的结合。最后，我们利用CRISPR/Cas9技术构建表达blebbistatin抗性的NM2的Hela细胞。