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文章主要分为以下几部分：
第一章葡萄糖激酶激动剂(GKA)的筛选及其药效学研究
研究目的:
寻找和发现新型葡萄糖激酶激动剂(GKA),并在细胞和动物水平上评价其抗糖尿病活性。
研究内容和实验方法:
(1)采用PCR克隆全长gk基因,构建重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)或Rosetta,表达、纯化目的蛋白并验证纯度,测定纯化酶活性,优化反应条件,建立分子水平葡萄糖激酶激动剂筛选模型,开展化合物筛选,寻找活性化合物(GKA)。
(2)对活性化合物进行酶动力学研究。
(3)采用大鼠原代培养肝细胞模型评价活性化合物对葡萄糖摄取、糖原合成和葡萄糖输出的作用。
(4)在正常小鼠、ob/ob或db/db糖尿病小鼠模型上开展体内抗糖尿病作用评价。
结果:
(1)分别从大鼠肝脏组织和人胰岛cDNA克隆中获取了大鼠肝脏和人胰岛gk编码基因,并构建了rlgk-pET28a、higk-pET28a重组质粒。重组质粒在大肠杆菌中获得了高效表达,并通过亲和纯化获得了高纯度的大鼠肝脏和人胰岛GK重组酶。酶活测定表明,重组酶具有高度活性,且符合GK的酶动力学特征;其活性受D-GIuNAc显著抑制,且阳性化合物Azh-10、PSN-GK1等对酶活及其动力学参数的影响与报道相符,从而建立了准确、可靠的筛选模型。
(2)对不同来源的数千个化合物进行筛选,发现了一系列具有良好GK激动活性的化合物,代表化合物为R-9k和Azh-557,其EC50分别为26nM和89nM,并使S0.5值分别降低了7.21倍和8.16倍,但对Vmax和nH无明显影响。
(3)在原代培养的大鼠肝细胞中,R-9k,Azh-557显著增加2-脱氧-D-[3H]-葡萄糖摄取、糖原合成;Azh-557同时降低肝细胞葡萄糖的产生。
(4)R-9k,Azh-557单次口服给药后可对ICR、C57BL/6J、ob/ob和db/db小鼠产生显著的、剂量依赖性的降血糖作用。
结论:
在分子酶学水平上建立了快速、高效、准确的GKA筛选模型,发现化合物R-9k和Azh-557具有明显的GK激动活性,并在正常小鼠和糖尿病小鼠中显示出良好的降血糖作用。