论文部分内容阅读
棉花(GossypiumhirsutumL.)是全球最重要的经济作物之一，虽然近些年的种植面积不断增长，但其生产仍难满足需求。常规育种方法在棉花生产上作出了巨大的贡献，但近年来由于日益严重的病虫害和杂草的危害，使棉花的单位面积产量和质量受到了严重的影响，因此培育新的高产多抗品种显得尤为重要。基因工程育种在培育作物抗性品种方面与常规育种方法相比有着得天独厚的优势，如抗性基因资源丰富、无种属限制、育种周期短、成本低、抗性受环境影响小等，现被广泛采用。然而，由于目前棉花基因转化选择标记多为令人担忧的抗生素抗性基因，并且转化周期长、假阳性率高、转化率低，因此迫切需要新的、安全的标记基因和新的转化体系来替代。为此，本研究的目的，一方面是以抗草甘膦基因aroA-M1作为棉花转化的选择标记探讨其可行性，并建立以茎尖为外植体的新型农杆菌转化体系，从而为棉花基因工程建立新型转化平台；另一方面，是将抗草甘膦基因aroA-M1和抗虫Bt基因导入到性状优良的当前主栽棉花品种中，获得既抗草甘膦又抗虫的双抗转基因棉花，为培育拥有我国自主知识产权的抗除草剂转基因棉花品种奠定基础。
草甘膦作为除草剂Roundup(R)的活性成份，具有广谱、高效、低毒、杂草难以产生抗性等特点，是一种理想的除草剂。其杀草机理主要是通过抑制芳香族氨基酸合成途径中的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosatesynthase，EPSPS)的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终杀死杂草和作物。aroA-M1基因是利用基因优化(DNAshuffling)方法通过重组大肠杆菌(Escherichiacoli)和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)EPSP合成酶基因获得的突变体。检测结果表明，其表达产物EPSP合成酶对草甘膦的亲和力明显降低，对PEP的结合能力明显升高，从而大幅度提高了转基因作物对草甘膦的抗性，这已在烟草和油菜的转化中得到证明。Bt基因是根据天然CryⅠAc和CryⅠAb的氨基酸序列和使用植物偏好密码子人工合成的，由中科院微生物所提供。本研究以pCAMBIA1300为基本载体，构建了pGRA1300(抗虫)和pAM1Bt(抗草甘膦抗虫)两个植物表达载体。为了提高aroA-M1基因的表达效率，因此选用了增强的组成型35S启动子(CaMV35S)，并在其上游还连接了来自拟南芥EPSPS基因叶绿体转运肽ASP(Arabidopsissignalpeptide)的核苷酸编码序列。
本研究采用农杆菌介导法，以aroA-M1基因作为选择标记和草甘膦作为筛选剂，分别以棉花下胚轴和茎尖为外植体对优良陆地棉栽培品种中棉35、中棉27、石远321以及棉花转化模式品种珂字棉312中进行了转化。为了改善棉花的转化效率，本研究还对影响农杆菌介导转化法转化效率的多个因子进行了优化，并建立了以aroA-M1基因为选择标记、以茎尖为外植体的新型棉花转化体系。
本研究接种中棉35号、中棉27号、石远321和珂字312下胚轴外植体数分别为3000、1468、1662和915块，得到的再生棉株数分别为59、43、58和41株。对获得的再生植株进行PCR分子检测发现，93.3％以上均能扩增得到1.3-kb的aroA-M1特异片段，78.9％以上能扩增得到0.96-kb的Bt特异片段。就转化率而言，中棉35号转化率最低，为1.90±0.15％；其次为中棉27号，2.86±0.37％，石远321转化率为3.43±0.32％，转化率最高为珂字312，4.26±0.45％。检测结果还发现，在T-DNA整合到棉花基因组过程中大约有15％的Bt基因丢失。接种中棉35号、中棉27号、石远321和珂字312茎尖外植体数分别为843、899、730和1115个，得到的再生棉株数分别为7、8、7和12株。对获得的再生植株进行PCR分子检测发现，所有再生植株aroA-M1基因和Bt基因均呈阳性。转化率计算结果表明，中棉35号转化率最低，为0.83±0.07％；其次为中棉27号，0.89±0.13％；石远321转化率为0.96±0.12％；转化率最高为珂字312，1.07±0.09％。
Southern杂交结果显示，约62.5％的再生苗为单位点插入，22.5％为双拷贝，15％为多拷贝；Western杂交检测表明，Southern检测呈阳性的植株分别出现了预期的42kDa(EPSPS)和68kDa(Bt)大小的蛋白迁移条带，表明aroA-M1基因和Bt基因在再生植株体内进行了正确的表达；对T0代转化植株进行的离体草甘膦抗性实验结果表明，4个品种Western杂交检测呈阳性的转基因棉花抗性同野生型相比，提高了4-6倍；T0代Western杂交检测呈阳性的转化植株整株草甘膦喷洒实验表明，78.6％的植株的抗性可达到商业应用标准0.84kg/ha，最高抗性可达4.2kg/ha。
对T1代(T0代自交种子)进行草甘膦抗性分析表明，除了少数株系不符合孟德尔遗传规律外，大多数转化株系的草甘膦抗性分离比均符合孟德尔一对(3∶1)或两对(15∶1)基因的分离规律。PCR检测和Western杂交检测进一步证明aroA-M1和Bt两个基因能够在转基因后代中稳定地遗传和表达。
综上所述，本文采用农杆菌介导法，分别以棉花下胚轴切段和茎尖为外植体，以aroA-M1为选择标记，成功地将草甘膦抗性基因aroA-M1和抗虫Bt基因导入到了3个优良棉花品种中；对转基因当代和子代的分子生物学检测和生物学检测结果表明，草甘膦抗性基因aroA-M1和抗虫Bt基因能够稳定地遗传给后代并进行高效的表达。