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目的:采用层析等方法从眼镜蛇毒中提取得到电泳纯NGF冻干粉并对其进行活性鉴定。研究提取的眼镜蛇毒NGF对rBMSC的软骨诱导作用。进一步采用仿生软骨基质-胶原水凝胶复合BMSC建立体外软骨诱导模型，考察眼镜蛇毒NGF对体外软骨诱导模型的作用。
方法:采用SephadexG-75凝胶过滤，CMSepharoseCL-6B离子交换柱层析等生物技术分离纯化得到NGF冻干粉;运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度;作用于PC12细胞，考察其活性。
体外分离和培养rBMSC并进行表型鉴定;眼镜蛇毒NGF作用rBMSC实验分为空白组、阳性对照组(TGF-β1诱导)和NGF浓度组N1(3μg/ml)、N2(6μg/ml)、N3(12μg/ml)，共5组，长状态良好的第三代rBMSC接种于24孔板中，每孔2×104个细胞，各组培养时间分为7天和14天;实验通过RT-PCR检测各组软骨相关的基因是否表达及表达差异;免疫组化检测Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的表达情况;HE染色观察各组细胞形态;荧光染色观察细胞存活状况;利用DMMB检测细胞分泌的GAG含量;以研究自提取的眼镜蛇毒NGF冻干粉对rBMSC的软骨诱导作用。
采用胶原水凝胶结合生长因子构建体外软骨诱导模型，考察模型对rBMSC的诱导作用，实验分组:空白组(K组，细胞微团)，BT组(细胞微团+TGF-β1诱导液)，BC组(rBMSC+胶原水凝胶)，BCT组(rBMSC+胶原水凝胶+TGF-β1诱导液)，共4组，每组分别培养14、28天;采用RT-PCR技术检测软骨形成过程中的特异性基因和相关基因;检测不同时间段各组GAG分泌情况;通过钙黄绿素/PI和鬼笔环肽/33258两组荧光染色，观察三维培养细胞的存活情况和细胞基质分泌情况;通过HE染色观察各组中细胞的形态;以判断体外软骨诱导模型的有效性。
进一步考察眼镜蛇毒NGF对体外软骨诱导模型的作用，考察其软骨诱导作用。实验设立BCN组(rBMSC+胶原水凝胶+眼镜蛇毒NGF，6μg/ml)，与前部分实验相比较，研究眼镜蛇毒NGF的软骨诱导作用。
结果:经层析法、透析、冻干和鉴定得到具有生物活性的电泳纯眼镜蛇毒NGF冻干粉;眼镜蛇毒NGF冻干品作用PC12细胞，随浓度增加，作用效果有所提升。
rBMSC原代培养，随时间延长，细胞密度增多，状态良好，特异性抗原检测均为阳性;考察眼镜蛇毒NGF的诱导作用，采用荧光染色观察细胞存活情况，HE染色观察细胞状态，均显示TGF处理组和眼镜蛇毒NGFN2浓度组活细胞多，并且呈软骨细胞形态和软骨陷窝结构;免疫组化检测，各组均表达Ⅰ型胶原，只有TGF处理组和N2浓度组表达Ⅱ型胶原:TGF处理组和N2浓度组细胞分泌的GAG含量最多(P＜0.01)，各组GAG分泌随时间增加而增多;PCR结果也显示，TGF处理组和N2浓度组，软骨特异性基因和相关基因表达最好，且随着时间的延长，相对表达上调。
体外构建软骨诱导模型，荧光染色结果显示，支架材料加细胞处理组(BC组)和支架材料加细胞和生长因子处理组(BCT组)，活细胞密度最大，细胞外基质分泌也最多，并随时间延长而增加。BCT组中出现了与正常软骨相似的软骨陷窝样机构，陷窝内细胞呈圆形或椭圆形;GAG检测，也显示为BC组和BCT组分泌最多，各组随时间延长GAG分泌增多。PCR结果显示，BC组和BCT组，各软骨相关基因表达最高，并随时间延长而上调。也只有BC组和BCT组表达软骨标志性基因ColⅠ、ColⅩ。结果表明采用生长因子、胶原水凝胶复合BMSC可构建软骨诱导模型，与体内软骨较为接近。
眼镜蛇毒NGF对软骨诱导模型的作用BCN组)，与TGF组相比，活细胞密度和基质分泌较高，HE染色情况也相似与BCT组;GAG含量检测也与BCT组相当。各软骨相关基因检测结果与BCT组相似。表明眼镜蛇毒NGF对软骨诱导模型具有较强的诱导作用。
结论:通过层析等方法能够从眼镜蛇毒中分离得到具有生物活性的电泳纯NGF;眼镜蛇毒NGF对rBMSC无增值活性，但它能促进rBMSC成软骨分化;采用三维仿生支架材料加细胞和转化生长因子β1可构建仿生软骨模型，进一步研究眼镜蛇毒NGF对软骨诱导模型的作用，结果表明眼镜蛇毒NGF具有与TGF-β1的作用效果相当的软骨诱导作用。因此，眼镜蛇毒NGF有望作为TGF-β1的替代生长因子用于软骨缺损修复，且具有提取工艺简单，成本低廉的优势。
方法:采用SephadexG-75凝胶过滤，CMSepharoseCL-6B离子交换柱层析等生物技术分离纯化得到NGF冻干粉;运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度;作用于PC12细胞，考察其活性。
体外分离和培养rBMSC并进行表型鉴定;眼镜蛇毒NGF作用rBMSC实验分为空白组、阳性对照组(TGF-β1诱导)和NGF浓度组N1(3μg/ml)、N2(6μg/ml)、N3(12μg/ml)，共5组，长状态良好的第三代rBMSC接种于24孔板中，每孔2×104个细胞，各组培养时间分为7天和14天;实验通过RT-PCR检测各组软骨相关的基因是否表达及表达差异;免疫组化检测Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的表达情况;HE染色观察各组细胞形态;荧光染色观察细胞存活状况;利用DMMB检测细胞分泌的GAG含量;以研究自提取的眼镜蛇毒NGF冻干粉对rBMSC的软骨诱导作用。
采用胶原水凝胶结合生长因子构建体外软骨诱导模型，考察模型对rBMSC的诱导作用，实验分组:空白组(K组，细胞微团)，BT组(细胞微团+TGF-β1诱导液)，BC组(rBMSC+胶原水凝胶)，BCT组(rBMSC+胶原水凝胶+TGF-β1诱导液)，共4组，每组分别培养14、28天;采用RT-PCR技术检测软骨形成过程中的特异性基因和相关基因;检测不同时间段各组GAG分泌情况;通过钙黄绿素/PI和鬼笔环肽/33258两组荧光染色，观察三维培养细胞的存活情况和细胞基质分泌情况;通过HE染色观察各组中细胞的形态;以判断体外软骨诱导模型的有效性。
进一步考察眼镜蛇毒NGF对体外软骨诱导模型的作用，考察其软骨诱导作用。实验设立BCN组(rBMSC+胶原水凝胶+眼镜蛇毒NGF，6μg/ml)，与前部分实验相比较，研究眼镜蛇毒NGF的软骨诱导作用。
结果:经层析法、透析、冻干和鉴定得到具有生物活性的电泳纯眼镜蛇毒NGF冻干粉;眼镜蛇毒NGF冻干品作用PC12细胞，随浓度增加，作用效果有所提升。
rBMSC原代培养，随时间延长，细胞密度增多，状态良好，特异性抗原检测均为阳性;考察眼镜蛇毒NGF的诱导作用，采用荧光染色观察细胞存活情况，HE染色观察细胞状态，均显示TGF处理组和眼镜蛇毒NGFN2浓度组活细胞多，并且呈软骨细胞形态和软骨陷窝结构;免疫组化检测，各组均表达Ⅰ型胶原，只有TGF处理组和N2浓度组表达Ⅱ型胶原:TGF处理组和N2浓度组细胞分泌的GAG含量最多(P＜0.01)，各组GAG分泌随时间增加而增多;PCR结果也显示，TGF处理组和N2浓度组，软骨特异性基因和相关基因表达最好，且随着时间的延长，相对表达上调。
体外构建软骨诱导模型，荧光染色结果显示，支架材料加细胞处理组(BC组)和支架材料加细胞和生长因子处理组(BCT组)，活细胞密度最大，细胞外基质分泌也最多，并随时间延长而增加。BCT组中出现了与正常软骨相似的软骨陷窝样机构，陷窝内细胞呈圆形或椭圆形;GAG检测，也显示为BC组和BCT组分泌最多，各组随时间延长GAG分泌增多。PCR结果显示，BC组和BCT组，各软骨相关基因表达最高，并随时间延长而上调。也只有BC组和BCT组表达软骨标志性基因ColⅠ、ColⅩ。结果表明采用生长因子、胶原水凝胶复合BMSC可构建软骨诱导模型，与体内软骨较为接近。
眼镜蛇毒NGF对软骨诱导模型的作用BCN组)，与TGF组相比，活细胞密度和基质分泌较高，HE染色情况也相似与BCT组;GAG含量检测也与BCT组相当。各软骨相关基因检测结果与BCT组相似。表明眼镜蛇毒NGF对软骨诱导模型具有较强的诱导作用。
结论:通过层析等方法能够从眼镜蛇毒中分离得到具有生物活性的电泳纯NGF;眼镜蛇毒NGF对rBMSC无增值活性，但它能促进rBMSC成软骨分化;采用三维仿生支架材料加细胞和转化生长因子β1可构建仿生软骨模型，进一步研究眼镜蛇毒NGF对软骨诱导模型的作用，结果表明眼镜蛇毒NGF具有与TGF-β1的作用效果相当的软骨诱导作用。因此，眼镜蛇毒NGF有望作为TGF-β1的替代生长因子用于软骨缺损修复，且具有提取工艺简单，成本低廉的优势。