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目的:
建立β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)致PC12细胞损伤模型，观察桑椹提取物(ME)的保护作用并确定其有效剂量;应用基因芯片技术筛选ME干预PC12细胞损伤的差异表达基因并加以验证，阐明ME神经保护作用的分子机制。
方法:
1.培养PC12细胞，用不同浓度的Aβ25-35(即终浓度分别为5、10、20、40μmol/L)处理细胞24h，采用MTT法确定Aβ25-35的损伤浓度。
2.用不同浓度的ME(终浓度分别为25、50、100、200、400、800μg/ml)预孵育细胞24h，再给予20μmol/LAβ25-35继续损伤24h，采用MTT法检测细胞存活率的改变并筛选ME的干预剂量。
3.选取200μg/ml作为ME的有效干预剂量，观察ME对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用。采用分子探针DCFH-DA、Hoechst33342染色法及JC-10荧光探针分别进行细胞内活性氧(ROS)含量、细胞凋亡及线粒体膜电位(MMP)水平的检测。
4.应用基因芯片技术检测ME干预Aβ25-35处理PC12细胞全基因组范围基因mRNA表达水平的变化，筛选出ME作用的差异表达基因，并对基因群刺激特异性的变化特征和规律进行描述。
5.采用RT-PCR检测ME干预Aβ25-35处理PC12细胞中基因Apafl、Bace2及Plcb4mRNA的表达;Westernblot技术检测Bace2蛋白的表达。
结果:
1.细胞的存活率随Aβ25-35浓度的增加而逐渐降低;当Aβ25-35浓度高达20μmol/L时，细胞存活率为(49.79±14.16)％，此浓度接近半抑制率值，可作为损伤浓度。
2.ME对Aβ25-35所致PC12细胞损伤具有保护作用，其有效浓度为100μg/ml和200μg/ml，分别使细胞存活率升高了(17.8±0.3)％和(20.7±2.74)％。选取200μg/ml作为ME的有效干预剂量。
3.与对照组比较，Aβ25-35组细胞内ROS的生成显著升高(P＜0.05)、细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)、MPP水平显著下降(P＜0.05);与Aβ25-35组比较，200μg/mlME预孵育组细胞内ROS的生成显著减少(P＜0.05)，细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)，且能抑制由Aβ25-35所致细胞线粒体膜电位的下降(P＜0.05)。
4.基因芯片共分析了24，358个基因。结果显示，①与对照组比较，Aβ25-35组5个基因上调，占基因总数的0.02％，16个基因下调，占基因总数0.07％;②与Aβ25-35组比较，200μg/mlME干预组中55个基因上调，占基因总数的0.2％，98个基因下调，占基因总数的0.4％;③经聚类分析，200μg/mlME干预组中聚簇的基因共144条;根据GO(Gene Ontology)功能分析，经ME干预后所筛选出的差异基因主要涉及细胞粘附、肽酶活性、细胞因子活性、离子结合活性及调节血管生成等功能;④结合NCBI相关数据库发现，在筛选出的差异基因中，Apaf1、Bace2和Plcb4等3个基因不仅在“Alzheimersdisease-referencepathway”中富集(P＜0.01)，而且ME干预后其基因表达水平均明显下调(P＜0.05)。
5.RT-PCR结果显示，与对照组比较，20μmol/LAβ25-35能够明显上调PC12细胞中Apaf1mRNA、Bace2mRNA及Plcb4mRNA的表达(P＜0.05);与Aβ25-35组比较，200μg/mlME预孵育24h后能显著抑制Apaf1、Bace2及Plcb4mRNA表达的上调，差异具有显著性(P＜0.05)。上述结果与芯片实验的发现一致。
6.Westernblot检测结果显示，与对照组比较，20μmol/LAβ25-35处理PC12细胞24h后，BACE2蛋白表达明显增加(P＜0.05);而200μg/mlME预孵育后不能有效抑制Aβ25-35诱导的BACE2蛋白表达的上调(P＞0.05)。提示ME在转录水平而非翻译水平调控BACE2基因表达。
结论:
适宜剂量的桑椹提取物对Aβ25-35致PC12细胞损伤有明显的保护作用，其机制与抗氧化、抑制细胞凋亡、减轻线粒体氧化损伤以及调控Apaf1、Bace2和Plcb4等AD相关基因表达有关。
建立β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)致PC12细胞损伤模型，观察桑椹提取物(ME)的保护作用并确定其有效剂量;应用基因芯片技术筛选ME干预PC12细胞损伤的差异表达基因并加以验证，阐明ME神经保护作用的分子机制。
方法:
1.培养PC12细胞，用不同浓度的Aβ25-35(即终浓度分别为5、10、20、40μmol/L)处理细胞24h，采用MTT法确定Aβ25-35的损伤浓度。
2.用不同浓度的ME(终浓度分别为25、50、100、200、400、800μg/ml)预孵育细胞24h，再给予20μmol/LAβ25-35继续损伤24h，采用MTT法检测细胞存活率的改变并筛选ME的干预剂量。
3.选取200μg/ml作为ME的有效干预剂量，观察ME对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用。采用分子探针DCFH-DA、Hoechst33342染色法及JC-10荧光探针分别进行细胞内活性氧(ROS)含量、细胞凋亡及线粒体膜电位(MMP)水平的检测。
4.应用基因芯片技术检测ME干预Aβ25-35处理PC12细胞全基因组范围基因mRNA表达水平的变化，筛选出ME作用的差异表达基因，并对基因群刺激特异性的变化特征和规律进行描述。
5.采用RT-PCR检测ME干预Aβ25-35处理PC12细胞中基因Apafl、Bace2及Plcb4mRNA的表达;Westernblot技术检测Bace2蛋白的表达。
结果:
1.细胞的存活率随Aβ25-35浓度的增加而逐渐降低;当Aβ25-35浓度高达20μmol/L时，细胞存活率为(49.79±14.16)％，此浓度接近半抑制率值，可作为损伤浓度。
2.ME对Aβ25-35所致PC12细胞损伤具有保护作用，其有效浓度为100μg/ml和200μg/ml，分别使细胞存活率升高了(17.8±0.3)％和(20.7±2.74)％。选取200μg/ml作为ME的有效干预剂量。
3.与对照组比较，Aβ25-35组细胞内ROS的生成显著升高(P＜0.05)、细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)、MPP水平显著下降(P＜0.05);与Aβ25-35组比较，200μg/mlME预孵育组细胞内ROS的生成显著减少(P＜0.05)，细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)，且能抑制由Aβ25-35所致细胞线粒体膜电位的下降(P＜0.05)。
4.基因芯片共分析了24，358个基因。结果显示，①与对照组比较，Aβ25-35组5个基因上调，占基因总数的0.02％，16个基因下调，占基因总数0.07％;②与Aβ25-35组比较，200μg/mlME干预组中55个基因上调，占基因总数的0.2％，98个基因下调，占基因总数的0.4％;③经聚类分析，200μg/mlME干预组中聚簇的基因共144条;根据GO(Gene Ontology)功能分析，经ME干预后所筛选出的差异基因主要涉及细胞粘附、肽酶活性、细胞因子活性、离子结合活性及调节血管生成等功能;④结合NCBI相关数据库发现，在筛选出的差异基因中，Apaf1、Bace2和Plcb4等3个基因不仅在“Alzheimersdisease-referencepathway”中富集(P＜0.01)，而且ME干预后其基因表达水平均明显下调(P＜0.05)。
5.RT-PCR结果显示，与对照组比较，20μmol/LAβ25-35能够明显上调PC12细胞中Apaf1mRNA、Bace2mRNA及Plcb4mRNA的表达(P＜0.05);与Aβ25-35组比较，200μg/mlME预孵育24h后能显著抑制Apaf1、Bace2及Plcb4mRNA表达的上调，差异具有显著性(P＜0.05)。上述结果与芯片实验的发现一致。
6.Westernblot检测结果显示，与对照组比较，20μmol/LAβ25-35处理PC12细胞24h后，BACE2蛋白表达明显增加(P＜0.05);而200μg/mlME预孵育后不能有效抑制Aβ25-35诱导的BACE2蛋白表达的上调(P＞0.05)。提示ME在转录水平而非翻译水平调控BACE2基因表达。
结论:
适宜剂量的桑椹提取物对Aβ25-35致PC12细胞损伤有明显的保护作用，其机制与抗氧化、抑制细胞凋亡、减轻线粒体氧化损伤以及调控Apaf1、Bace2和Plcb4等AD相关基因表达有关。