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从感染人群数量、危及的地理范围、流行趋势和健康危害程度来看，华支睾吸虫病是我国目前最重要的食源性寄生虫病之一，而华支睾吸虫感染引发的食品安全问题和终宿主的肝胆管疾病也引起卫生部门高度重视，卫生部2005年已将其列为重点防治的寄生虫病。2009年3月，华支睾吸虫也被WHO确认为引起肝胆管癌的病因学因素。寻找新的切实可行又行之有效的防治途径对于阻断华支睾吸虫病的传播流行尤为重要。基因组学、转录组学、蛋白质组学和分子生物学的迅速发展，为了解华支睾吸虫生长发育和生理代谢、阐明华支睾吸虫致病机制和筛选有效的华支睾吸虫病诊断、疫苗候选分子提供了有力的工具。 寄生虫产生的分泌/排泄蛋白(excretory/secretory proteins，ESP)直接涉及与宿主的相互作用，在寄生虫致病过程中发挥重要作用。已证实华支睾吸虫ESP是其致肝胆管病变的重要因素，但是ESP成分复杂，其中发挥这些作用的蛋白分子并不清楚。对华支睾吸虫ESP进行质谱分析可帮助我们鉴定其中的高丰度的分子，此外转录组研究有助于我们发现华支睾吸虫新基因，包括分泌型基因，并在此基础上鉴定出华支睾吸虫致肝、胆管病变的重要分子。另外，华支睾吸虫发育阶段发生了一系列复杂的形态和生理变化，需要适应不同的生活环境，结合华支睾吸虫基因组数据，对华支睾吸虫不同发育阶段、不同器官组织的转录组学进行研究有助于了解其在复杂的生活史过程中基因的调控、与生态环境的相互关系。 本研究在转录组测序的基础上，筛选出阶段特异及组织特异表达的分子亲肌素样蛋白、钙调样蛋白和虫体丰富表达的分子泛素家族蛋白，证实三者为华支睾吸虫ESP分子，并对三者进行生物学功能鉴定，初步探讨这几个分子在华支睾吸虫寄生、生理和致肝胆管病变中的作用，为研制新的华支睾吸虫病干预手段奠定理论基础。 1研究目的： 1.1对华支睾吸虫阶段转录组及不同组织转录组数据进行分析，了解华支睾吸虫转录组的基本特点，筛选出其中差异表达基因、分泌型基因及与华支睾吸虫寄生相关的基因等信息。 1.2初步鉴定华支睾吸虫亲肌素样蛋白、钙调样蛋白、泛素家族蛋白的生物学功能； 2研究方法： 2.1华支睾吸虫转录组测序及分析 2.1.1转录组总RNA样品制备 分别提取华支睾吸虫成虫、囊蚴，成虫吸盘、肌肉、睾丸和卵巢的总RNA，检测合格后用于RNA测序，RNA测序方法基于Solexa测序技术第二代分析系统IlluminaGenome AnalyzerⅡx。 2.1.2转录组测序、组装、拼接和注释 采用Fastx-tools软件对原始测序数据进行过滤，高质量数据采用Velvet软件进行组装；公共数据库中现有的华支睾吸虫EST序列采用Newbler Assembler程序进行组装；blast、OrfPredictor软件预测华支睾吸虫全长编码基因，采用TopHat软件将RNA数据在基因组上定位。 2.1.3华支睾吸虫转录组分析 1)Cuffldiff和Blast2GO软件分析华支睾吸虫成虫、囊蚴高表达及差异表达基因并获得其聚类情况； 2)Cuffidiff和Blast2GO软件分析吸盘、肌肉、睾丸、卵巢四个组织中差异表达基因并获得其聚类情况； 3)SignalP3.0 Server或Secretome2.0 Server分析并结合TMHMM Server v2.0、TargetPServer v1.01分析华支睾吸虫分泌型基因； 4)Ensembl API的altSpliceFinder程序分析华支睾吸虫基因可变剪接模式； 5)tRNAscan-SE和Infernal1.0分析非编码RNA。 2.2华支睾吸虫3个ESP分子(CsMLP、CsCLP和CsPUB)的功能研究 2.2.1 CsMLP、CsCLP和CsPUB的生物信息学分析 Blastx从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出三个蛋白的编码基因，并与GenBank中的其他物种同源蛋白序列比对。ProtParam、SignalP、TargetP、InterProScan、Motifscan、对三个蛋白基本特性进行分析。 2.2.2 CsMLP、CsCLP和CsPUB阶段性转录的分析 分别提取囊蚴、成虫、及虫卵阶段的总RNA，反转录成相应的cDNA，用荧光定量PCR的方法，以cDNA为模板利用特异引物扩增目的基因及内参基因，了解目的基因在虫体不同发育阶段的转录情况及差异表达水平。 2.2.3 CsMLP、CsCLP和CsPUB原核表达重组蛋白的获取及抗重组蛋白IgG的制备 应用分子克隆技术构建原核表达质粒，依据目的基因的ORF和原核质粒pET-28a(+)酶切位点特点，用PrimerPrimer5.0软件设计引物，PCR扩增出编码序列，利用相应的限制性内切酶对PCR产物和空质粒pET-28a(+)同时进行双酶切，纯化酶切产物，连接酶连接转化到大肠杆菌。利用菌液PCR，双酶切和测序的方法鉴定重组质粒。构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌BL21/DE3，IPTG的诱导表达重组蛋白，经SDS-PAGE分析后，利用镍柱进行His亲和层析纯化。用纯化的重组蛋白免疫SD大鼠，并对取得的免疫血清进行IgG纯化。 2.2.4 CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白的免疫学特性 将重组蛋白行12％SDS-PAGE后转移至PVDF膜，然后将PVDF膜分别置于大鼠抗重组蛋白血清、感染华支睾吸虫的大鼠血清和正常大鼠血清以及不同寄生虫感染病人的血清中反应，最后将膜置于兔抗大鼠/人IgG-HRP二抗，显色观察。 2.2.5 CsMLP、CsCLP和CsPUB作为ESP成分的鉴定 Western blotting方法，分别用抗重组蛋白IgG和正常大鼠IgG作为一抗对华支睾吸虫成虫的ESP进行识别；或分别用华支睾吸虫成虫ESP的大鼠免疫血清和正常的大鼠血清作为一抗对重组蛋白进行识别，二抗孵育后显色观察。 2.2.6 CsMLP、CsCLP和CsPUB在华支睾吸虫虫体的分布情况 将华支睾吸虫成虫、囊蚴分别用甲醛固定后，用石蜡包埋切片。切片脱蜡脱水后，以抗重组蛋白IgG为一抗，Cy3标记的羊抗大鼠IgG(H+L)为荧光二抗，用自发荧光淬灭剂将组织的自发荧光淬灭后，在正置荧光显微镜下观察三者在华支睾吸虫成虫、囊蚴中的组织定位情况。 用荧光定量PCR的方法，以成虫口咽部及虫体其他部位的cDNA为模板利用CsMLP、CsCLP特异引物扩增目的基因及内参基因，了解两者在虫体不同组织转录情况及差异表达水平。 2.2.7 CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白的生物学功能研究 1)重组CsMLP、CsCLP的actin结合功能分析 actin经过SDS-PAGE转移到PVDF膜上后，分别以CsMLP和CsCLP重组蛋白孵育膜，再分别以抗CsMLP重组蛋白IgG、抗CsCLP重组蛋白IgG为一抗，二抗孵育后显示观察。 2)CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白对体外培养的肝星状细胞的影响 ①CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白与HSC结合 将HSC与重组蛋白孵育后以抗重组蛋白IgG作为一抗，设立对照组(不加蛋白组，正常大鼠IgG及不加一抗组)，二抗孵育后，Hochest染核，细胞免疫荧光法鉴定重组蛋白与HSC的结合。 ②CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白对HSC的增殖作用 用5μg/ml、10μg/ml的重组蛋白体外与HSC孵育24h，设立PBS组及无关蛋白组对照，应用Edu标记法测定重组蛋白对肝星状细胞的增殖作用。 ⑧CsMLP、CsCLP重组蛋白对HSC中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响 用5μg/ml、10μg/ml的重组蛋白体外与HSC孵育24h，设立PBS组及无关蛋白组对照，收集细胞裂解提取细胞总蛋白后SDS-PAGE、以抗α-SMA单抗为一抗，Westernblotting观察各组α-SMA的表达情况。 3)CsPUB重组蛋白对体外培养的胆管癌细胞(EGI)的影响 在生长因子存在时加入10μg/ml的CsPUB重组蛋白，设立对照，与EGI孵育15min、60min、180min后，固定细胞，以生长因子受体单抗为一抗，利用细胞免疫荧光法检测EGI中生长因子受体内化及降解情况。 3研究结果： 3.1华支睾吸虫转录组测序及分析 3.1.1转录组测序、组装、拼接和注释 华支睾吸虫成虫转录组获得4.7G、31，965，153个读长的数据，获得30530条Unigene、13289个CDS；囊蚴获得1.1G、6，388，889个读长的数据，获得64934条Unigene、24560个CDS。各组织转录组测序共产生98.69 Mb的高质量测序数据。基于前期基因组分析产生的16，258个基因模型，共获得27，082个可注释转录本。 3.1.2华支睾吸虫转录组分析 1)成虫和囊蚴差异表达基因及聚类 成虫和囊蚴两个阶段都表达差异基因1766个，而在其中任一个阶段中表达的差异基因2560个，差异表达的基因在66个GO功能上富集，17个KEGG通路上富集。 2)四个组织差异表达基因 肌肉与吸盘、睾丸、卵巢的差异表达基因分别为1，094个、1，043个和1，315个，而卵巢和睾丸之间的差异表达基因为516个。 3)分泌型基因 分析获得297个可能的分泌型基因，其中119个基因可归为10个主要的分子功能类别，143个可归于20个主要的生物学过程(biological process)类别。 4)可变剪接 成虫可变剪接事件1774，囊蚴为225，采用11种不同的剪接模式，主要以起始位点变异最常见；四个不同组织转录组产生14，087个可剪接转录本，发现4，821个新转录本。 3.2华支睾吸虫3个ESP分子(CsMLP、CsCLP和CsPUB)的功能研究 3.2.1 CsMLP、CsCLP和CsPUB的生物信息学分析 获得三个蛋白的编码区长度、DNA长度、内含子情况；CsMLP和CsCLP含有calponin结构域，CsPUB含有5个泛素单体；三个蛋白均无典型的分泌信号肽，也无跨膜区，存在膜外，可能为非经典途径分泌；除CsCLP外，CsMLP和CsPUB在溶液中很稳定。 3.2.2 CsMLP、CsCLP和CsPUB阶段性转录的分析 三者在华支睾吸虫囊蚴的转录水平均高于成虫，具有统计学差异，虫卵中不存在CsMLP和CsCLP的mRNA，而CsPUB在虫卵阶段也转录。 3.2.3 CsMLP、CsCLP和CsPUB原核表达重组蛋白的获取及抗重组蛋白IgG的制备 转化了重组质粒的大肠杆菌在诱导剂IPTG诱导下表达目的蛋白，经SDS-PAGE证实表达的融合蛋白与预测分子量大小相符，且融合的His标签单抗可特异识别此条带，确定获得的重组蛋白为目的蛋白。CsCLP和CsPUB重组蛋白免疫大鼠血清经过纯化后的IgG滴度可达2，5600，CsMLP重组蛋白的达到6，400。 3.2.4 CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白的免疫学特性 重组蛋白经SDS-PAGE后，Western blotting分析，大鼠抗重组蛋白血清、感染华支睾吸虫的大鼠血清可在相应分子量处出现识别条带，而正常大鼠血清不能，说明重组蛋白具有免疫原性和免疫反应性；日本血吸虫、细粒棘球绦虫和猪肉绦虫感染病人的血清中也可识别重组蛋白，表明重组蛋白具有免疫交叉反应。 3.2.5 CsMLP、CsCLP和CsPUB作为ESP成分的鉴定 Western blotting抗重组蛋白IgG可识别华支睾吸虫成虫ESP中条带；华支睾吸虫成虫ESP的大鼠免疫血清可识别重组蛋白，而相应的对照组不出现，说明三个蛋白为华支睾吸虫ESP分子。 3.2.6 CsMLP、CsCLP和CsPUB在华支睾吸虫虫体的分布情况 CsMLP在华支睾吸虫成虫的口吸盘、咽部和体表肌层表达，在囊蚴的口吸盘和体壁表达：CsCLP在成虫口吸盘、腹吸盘、咽部、体表肌层、排泄孔分布，在囊蚴的口吸盘和体壁分布；CsPUB在虫体多个组织表达，在睾丸、卵巢、卵黄腺和虫卵分布较多。 用荧光定量PCR的方法，证实CsMLP和CsCLP在成虫口咽部的表达是虫体其他部位的28.3和15.5倍，具有统计学差异。 3.2.7 CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白的生物学功能研究 1)重组CsMLP、CsCLP的actin结合功能分析 凝胶覆盖分析显示CsMLP和CsCLP重组蛋白具有actin结合功能。 2)CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白对体外培养的肝星状细胞的影响 ①CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白与HSC结合 细胞免疫荧光法显示重组蛋白能与HSC细胞膜结合。 ②CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白对HSC的增殖作用 5μg/ml、10μg/ml的CsMLP、CsCLP重组蛋白体外与HSC孵育24h后，与对照组比较，其可促使HSC增殖，且与剂量成正比，而CsPUB重组蛋白没有此作用。 ③CsMLP、CsCLP重组蛋白对HSC中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响 在控制细胞总蛋白上样质量一致的情况下，与对照组比，5μg/ml、10μg/ml的重组蛋白体外与HSC孵育24h后，细胞内α-SMA的表达升高，且与剂量成正比。 3)CsPUB重组蛋白对体外培养的胆管癌细胞(EGI)的影响 在生长因子存在时加入10μg/ml的CsPUB重组蛋白，与EGI孵育15min、60min、180min后，固定细胞，以生长因子受体单抗为一抗，利用细胞免疫荧光法检测发现，与对照组比，前者可使生长因子受体内化及降解延迟。 4研究结论： 1.完成华支睾吸虫成虫、囊蚴阶段转录组以及华支睾吸虫不同组织(肌肉、吸盘、睾丸、卵巢)转录组测序，获得华支睾吸虫吸虫基因表达、阶段差异表达/组织差异表达、非编码RNA、可变剪接及分泌型基因等多方面的信息。 2.在转录组数据分析的基础上，筛选出CsMLP、CsCLP和CsPUB三个分泌型基因，并证实CsMLP和CsCLP在华支睾吸虫成虫和囊蚴的阶段差异表达、口咽部和虫体其他部位的组织差异表达，证实CsPUB在华支睾吸虫广泛分布、丰富表达，并证实CsMLP、CsCLP和CsPUB蛋白为华支睾吸虫成虫ESP分子。 3.获得了纯化、可溶性的CsMLP、CsCLP和CsPUB原核/真核重组蛋白及抗重组蛋白的IgG，证实了三者的免疫原性和免疫反应性。 4.掌握了CsMLP、CsCLP和CsPUB在华支睾吸虫虫体的分布情况，CsMLP和CsCLP在虫卵均不表达，在囊蚴均表达于吸盘和体壁，在成虫则定位于口吸盘、咽部和体表，CsCLP还分布在腹吸盘、排泄孔，这些部位均为富含平滑肌以及产生ESP的组织；CsPUB在虫卵有表达，在成虫的多个组织均有表达，表达无组织特异性。 5.CsMLP、CsCLP和CsPUB重组蛋白均可在体外与肝星状细胞结合，但前两者可以促使肝星状细胞增殖和活化，CsPUB重组蛋白不能促进肝星状细胞的增殖；在生长因子存在情况下，CsPUB重组蛋白可使体外培养的胆管癌细胞表达的生长因子受体内化、降解减缓。