论文部分内容阅读
本论文以产抗肿瘤抗生素grincamycin的深海放线菌StreptomyceslusitanusSCSIOLR32为研究对象。Grincamycin以角环素为母核连接5个糖配基，其中两个糖为酮糖，具有很好的抗各种肿瘤细胞和革兰氏阳性细菌的活性。角环素类抗生素是由Ⅱ型PKS形成的具有广泛生物活性及化学多样性的芳香多聚酮类化合物。本论文取得以下成果:
第一、从StreptomyceslusitanusSCSIOLR32中克隆了完整的grincamycin生物合成基因簇，对其进行测序及生物信息学分析。Grincamycin生物合成基因簇全长约37Kb，包含有31个开放阅读框，对各个基因的功能进行了注释。运用PCR技术从基因组文库中筛选出含有grincamycin生物合成基因簇的阳性克隆。
第二、为了验证各个基因的功能，利用PCR-targeting和接合转移等技术对基因簇中的10个基因进行阻断实验，构建了双交换突变菌株。基因阻断突变株通过抗性筛选及PCR的方法来验证。对突变株进行小规模发酵，通过化学手段分离出grincamycin同系物，通过分析各突变株的发酵产物及获得的部分中间体化合物，确定了部分基因的功能。
第三、利用本实验室构建的异源表达质粒pSCSIO1对包含有完整grincamycin生物合成基因簇的质粒进行异源宿主表达，在链霉菌S.coelicolor菌株中成功表达并获得了化合物vineomycinA1(P-1894B)，该化合物可能是grincamycin生物合成基因簇的终产物。
第四、对FAD依赖型脱氢酶GcnM的功能进行了研究，从突变株△gcnM中分离并获得了5个生物合成中间体结构衍生物。同时将GcnM蛋白进行表达及纯化，对获得的4个结构衍生物进行了体外酶催化反应。体外实验表明，GcnM负责grincamycin生物合成过程中末端糖基的修饰作用，能在突变株△gcnM产物两个糖链末端的两个糖基上进行四次脱氢反应，形成两个α，β-不饱和酮糖，GcnM对底物苷元部分的识别具有宽泛性。
本论文克隆、推测并确定了grincamycin部分基因的功能，成功地实现了深海来源的grincamycin的生物合成基因簇的异源表达，还通过体外和体内试验对GcnM的糖基后修饰功能进行了研究，揭示了其对底物苷元部分的模糊识别性。这些结果和发现，为我们深入研究grincamycin的生物合成机制，充分发掘其生物合成途径中功能基因的生物催化潜力奠定了基础。